体外分离源自凋亡T淋巴细胞的微颗粒

摘要

来源：Yang, C. 等，淋巴细胞微颗粒的制备及其对气道上皮细胞促凋亡作用的检测。J. Vis. Exp. (2015)

本视频展示了经放线菌素-D处理后，从T淋巴细胞中生成并分离T淋巴细胞来源的微颗粒（LMPs）的过程。

方案

1. 淋巴管内皮微粒的制备与表征

注意：为防止污染，确保本实验中使用的所有材料均为无菌或经过高压灭菌。除非另有说明，所有步骤均须在室温下于生物安全柜内的无菌条件下进行。

1. 微囊泡的刺激与收集
   1. 在37 °C水浴中解冻一份含有1000万CEM T细胞的冻存细胞。用10 ml预热的无血清造血细胞培养基（如X-VIVO）稀释，转移至15 ml无菌离心管中，以200 g 离心5 min。吸除上清液，将细胞重悬于5 ml预热的培养基中。
   2. 将细胞转移至一个T75组织培养瓶（适用于悬浮细胞），加入15 ml预热的造血细胞培养基（如X-VIVO），在37 °C、5% CO₂的湿润培养箱中培养4天。
   3. 4天后，将全部培养基和细胞转移至一个含有100 ml新鲜培养基的T175组织培养瓶中，在相同条件下继续培养约72小时，直至细胞密度达到200万个细胞/ml。
   4. 将细胞均等分至四个T175培养瓶中，每个瓶中含150 ml新鲜培养基，继续培养至细胞生长至约200万个细胞/ml（约需48小时培养）。
   5. 通过200 × g 离心5 min收集各培养瓶中的细胞，将300 × 10⁶个细胞重悬于一个新的T175培养瓶中，瓶内含150 ml新鲜培养基，以维持200万个细胞/ml的密度。
   6. 向培养基中加入放线菌素D（以DMSO溶解，浓度为2 mg/ml），终浓度为0.5 µg/ml，继续培养24小时。
   7. 将全部培养基转移至50 ml锥形离心管中，以750 × g 离心5 min以沉淀细胞。将上清液转移至新的50 ml锥形管中，再以1,500 × g 离心15 min，以去除较大的细胞碎片。
   8. 将上清液转移至250 ml离心瓶中，以12,000 × g 超速离心50 min。弃去上清液，收集沉淀物。
   9. 用40 ml无菌PBS在50 ml离心管中重悬富含LMPs的沉淀物，并以12,000 × g 离心50 min进行洗涤。重复此步骤两次。
   10. 收集最后一次洗涤的上清液，作为溶剂对照使用。将LMP沉淀物重悬于1 ml PBS中，转移至1.5 ml无菌微量离心管中。分装后将分离的LMPs储存于-80 °C（避免反复冻融）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CEM T细胞	ATCC	CCL-119
X-VIVO 15培养基	Cambrex, Walkersville	04-744Q
T75培养瓶	Sarstedt	83.1813.502
T175培养瓶	Sarstedt	83.1812.502
放线菌素D	Sigma Chemical Co.	A9415-2mg
PBS	Lifetechnologies	14190-144
0.22µm滤器	Sarstedt	83.1826.001
细胞培养箱	Mandel	Heracell 150
低速离心机	IEC	Centra8R
高速离心机	Beckman	Avanti J8
适用于250ml瓶的高速转子	Beckman	JLA16.250
适用于50ml离心管的高速转子	Beckman	JA30.50