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基于纳米颗粒的抗原特异性CD8+ T细胞富集与扩增

2025年7月8日

本文内容

摘要

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来源:Hickey, J. W.,利用磁性纳米颗粒富集与扩增稀有抗原特异性T细胞J. Vis. Exp. (2018)。

本视频介绍了一种利用磁性纳米颗粒为基础的磁性人工抗原提呈细胞(aAPCs)分离稀有抗原特异性CD8+ T细胞的实验方案,该aAPCs经抗原肽负载的MHC-Ig复合物及抗CD28抗体功能化修饰。aAPCs可特异性结合表达靶向该抗原肽的T细胞受体的CD8+ T细胞,并实现其后续扩增 体外,导致该 CD8+ T 细胞群体的富集与扩增。

方案

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所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 使用制备的纳米颗粒人工抗原呈递细胞富集抗原特异性CD8+ T细胞。

  1. 分离 CD8+ T 细胞。
    1. 通过暴露于异氟烷后行颈椎脱位法对动物实施安乐死。
    2. 从野生型 C57BL/6j 小鼠中取出脾脏和淋巴结,并将其置于 PBS 溶液中。研磨组织,并用 PBS 频繁冲洗,使细胞通过无菌的 70 µm 细胞筛滤器。
    3. 为去除非 CD8+ T 细胞,使用非接触式 CD8+ T 细胞分离试剂盒,并按照制造商说明书操作。
      注意:每种抗原条件至少需要 3 × 106 个 CD8+ T 细胞。
  2. 加入纳米颗粒人工抗原呈递细胞(aAPCs),使其与 CD8+ T 细胞结合。
    1. 分离后,将细胞浓缩至 100 µL PBS(含 0.5% 牛血清白蛋白(BSA)和 2 mM EDTA)中。
    2. 根据每 106 个 CD8+ T 细胞加入 1011 个与 aAPC 结合的肽段负载型 MHC-Ig 的比例,计算所需添加的 aAPC 数量。
    3. 将 aAPC 颗粒与 CD8+ T 细胞在无菌的 5 mL 聚苯乙烯圆底管中,于 4 °C 条件下持续混匀孵育 1 小时。
  3. 配制添加补充物的培养基和 T 细胞生长因子(TCGF),用于洗脱和培养 CD8+ T 细胞。
    1. 配制补充培养基:在完全 RPMI 1640 培养基(含谷氨酰胺)中添加 1× 非必需氨基酸、1 mM 丙酮酸钠、0.4× 维生素溶液、92 µM 2-巯基乙醇、10 µM 环丙沙星以及 10% 胎牛血清(FBS)。
    2. 按照既定方案制备 TCGF。
      注意:TCGF 是一种实验室自制的人源免疫细胞因子混合物,对于为 T 细胞提供生长所需的额外刺激信号至关重要。TCGF 可替换为已知的 T 细胞刺激性细胞因子,如 IL-2、IL-7 或 IL-15;但每种因子可能相应地诱导 T 细胞应答的极化。
  4. 洗涤并富集 aAPC 与 CD8+ T 细胞的混合物。
    1. 使用含 0.5% BSA 和 2 mM EDTA 的 PBS 缓冲液洗涤磁性颗粒 aAPC,依次用补充培养基洗涤一次,再用含 1% TCGF 的补充培养基洗涤一次。
    2. 用 500 µL 含 1% TCGF 的补充培养基洗脱 aAPC 及富集的 CD8+ T 细胞。
    3. 使用血细胞计数板计数细胞,并将细胞以每孔 160 µL 含 1% TCGF 的补充培养基接种至 96 孔 U 型底板中,细胞浓度为 2.5 × 105 个 CD8+ T 细胞/mL。
    4. 若使用的 aAPC 表面仅表达肽段负载型 MHC-Ig(无共刺激信号),则完成步骤 4.5;若使用的 aAPC 表面同时表达肽段负载型 MHC-Ig 和共刺激信号,则进入步骤 5。
  5. 向富集组分中加入表面包被共刺激信号的磁性颗粒,并施加磁场,使刺激信号在 T 细胞表面共聚集。
    1. 向富集组分中加入与颗粒上肽段负载型 MHC-Ig 数量等摩尔(或根据应用需求更高,参见 aAPC 特性调控部分)的刺激性抗体。
    2. 在 4 °C 条件下孵育 1 小时,使共刺激磁性颗粒与富集的 CD8+ T 细胞结合。
    3. 通过将培养板置于两个长度为 1.9 cm(0.75 英寸)的 N52 钕磁铁之间,施加磁场。
      注意:N52 钕磁铁具有极强的磁场。储存时应使用隔片将磁铁分开,避免相互吸附;在放置于培养板上时也需小心操作,以免难以分离。为减少磁铁与培养箱金属部件之间的吸附,可将磁铁分别置于底部和顶部的 50 mL 圆锥管泡沫容器中。

2. 使用制备好的纳米颗粒人工抗原呈递细胞扩增并检测抗原特异性CD8+ T细胞

  1. 将含有aAPCs和CD8+ T细胞的96孔U型底板置于含5% CO2、37 °C、加湿的培养箱中培养3天。第3天时,每孔加入80 μL含2% TCGF的完全培养基进行换液,并将细胞放回培养箱继续培养至第7天。
  2. 第7天时,将刺激后的细胞收集至5 mL圆底离心管中进行细胞计数。
  3. 待所有溶液收集完毕后,离心收集的细胞,并用含0.05%叠氮化钠和2% FBS的0.5 mL PBS重悬。通过台盼蓝染色并在血细胞计数板上计数,确定活细胞数量。
  4. 取50,000–500,000个已计数的细胞,分别转移至两个新的5 mL圆底离心管中,用于抗原特异性染色。其中一管用于同源肽-MHC染色,另一管用于非同源染色以确定背景染色水平。
  5. 在100 μL含0.05%叠氮化钠和2% FBS的PBS中,向相应的同源和非同源管中各加入1 μg生物素标记的MHC-Ig,以及别藻红蛋白(APC)偶联的大鼠抗小鼠CD8a抗体(克隆号53-6.7,稀释比例1:100),4 °C孵育1小时。
  6. 加入二抗链霉亲和素及活死细胞染料。通过离心洗涤去除未结合的生物素化MHC-Ig。随后,所有样本在4 °C避光孵育15分钟,加入PE标记的链霉亲和素(1:350稀释)和可固定的绿色活死细胞染料(1:1000稀释)进行染色。
  7. 使用流式细胞仪检测所有样本,以确定抗原特异性及抗原特异性细胞的数量。
    1. 通过离心去除多余的二抗和活死染料,用含0.05%叠氮化钠和2% FBS的150 μL PBS缓冲液重悬细胞,上机进行流式细胞术检测。
  8. 使用数据分析软件确定抗原特异性细胞的数量和百分比。
    1. 为确定抗原特异性细胞的百分比,依次设置以下门控:活细胞阳性(live+)、淋巴细胞(前向散射 vs. 侧向散射)、CD8+、Dimer+。通过比较非同源与同源染色样本设定Dimer+门控范围。
    2. 通过从同源MHC-Ig染色样本的Dimer+百分比中减去非同源MHC-Ig染色样本的Dimer+百分比,计算出样本中抗原特异性细胞的实际百分比。
    3. 将该抗原特异性细胞百分比乘以实际计数的细胞总数,即可获得富集与扩增后产生的抗原特异性细胞数量。
      注意:由于本实验所用荧光染料之间存在光谱重叠,需在流式细胞仪上正确设置补偿参数。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DimerX I:重组可溶性二聚体人 HLA-A2:Ig 融合蛋白BD Biosciences551263
DimerX I:重组可溶性二聚体小鼠 H-2D[b]:IgBD Biosciences551323
DimerX I:重组可溶性二聚体小鼠 H-2K[b]:Ig 融合蛋白BD Biosciences550750
nanomag-D-spio,NH2,100 nm 纳米颗粒Micromod 79-01-102
96 孔半面积黑色聚苯乙烯微孔板Corning3875
Super Mag NHS 活化磁珠,0.2 µmOcean NanotechSN0200
Anti-Biotin MicroBeads UltraPureMilteny130-105-637
EZ-Link NHS-BiotinThermoFisher20217
C57BL/6J(B6 野生型)小鼠Jackson Laboratory664
CD8a+ T 细胞分离试剂盒,小鼠Miltenyi130-104-075
MS 柱Milteny130-042-201
LS 柱Milteny130-042-401
链霉亲和素-藻红蛋白,SAvPEBiolegend405203
直径 0.75 英寸的 N52 圆盘磁铁K&J MagneticsDX8C-N52
APC 标记抗小鼠 CD8a 抗体,克隆 53-6.7Biolegend100711
LIVE/DEAD 可固定绿色死细胞染色试剂盒,适用于 488 nm 激发ThermoFisherL-34969

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标签

MHC Ig CD8 T T MHC Ig CD28

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