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所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。
1. 使用制备的纳米颗粒人工抗原呈递细胞富集抗原特异性CD8+ T细胞。
- 分离 CD8+ T 细胞。
- 通过暴露于异氟烷后行颈椎脱位法对动物实施安乐死。
- 从野生型 C57BL/6j 小鼠中取出脾脏和淋巴结，并将其置于 PBS 溶液中。研磨组织，并用 PBS 频繁冲洗，使细胞通过无菌的 70 µm 细胞筛滤器。
- 为去除非 CD8+ T 细胞，使用非接触式 CD8+ T 细胞分离试剂盒，并按照制造商说明书操作。
注意：每种抗原条件至少需要 3 × 106 个 CD8+ T 细胞。
- 加入纳米颗粒人工抗原呈递细胞（aAPCs），使其与 CD8+ T 细胞结合。
- 分离后，将细胞浓缩至 100 µL PBS（含 0.5% 牛血清白蛋白（BSA）和 2 mM EDTA）中。
- 根据每 106 个 CD8+ T 细胞加入 1011 个与 aAPC 结合的肽段负载型 MHC-Ig 的比例，计算所需添加的 aAPC 数量。
- 将 aAPC 颗粒与 CD8+ T 细胞在无菌的 5 mL 聚苯乙烯圆底管中，于 4 °C 条件下持续混匀孵育 1 小时。
- 配制添加补充物的培养基和 T 细胞生长因子（TCGF），用于洗脱和培养 CD8+ T 细胞。
- 配制补充培养基：在完全 RPMI 1640 培养基（含谷氨酰胺）中添加 1× 非必需氨基酸、1 mM 丙酮酸钠、0.4× 维生素溶液、92 µM 2-巯基乙醇、10 µM 环丙沙星以及 10% 胎牛血清（FBS）。
- 按照既定方案制备 TCGF。
注意：TCGF 是一种实验室自制的人源免疫细胞因子混合物，对于为 T 细胞提供生长所需的额外刺激信号至关重要。TCGF 可替换为已知的 T 细胞刺激性细胞因子，如 IL-2、IL-7 或 IL-15；但每种因子可能相应地诱导 T 细胞应答的极化。
- 洗涤并富集 aAPC 与 CD8+ T 细胞的混合物。
- 使用含 0.5% BSA 和 2 mM EDTA 的 PBS 缓冲液洗涤磁性颗粒 aAPC，依次用补充培养基洗涤一次，再用含 1% TCGF 的补充培养基洗涤一次。
- 用 500 µL 含 1% TCGF 的补充培养基洗脱 aAPC 及富集的 CD8+ T 细胞。
- 使用血细胞计数板计数细胞，并将细胞以每孔 160 µL 含 1% TCGF 的补充培养基接种至 96 孔 U 型底板中，细胞浓度为 2.5 × 105 个 CD8+ T 细胞/mL。
- 若使用的 aAPC 表面仅表达肽段负载型 MHC-Ig（无共刺激信号），则完成步骤 4.5；若使用的 aAPC 表面同时表达肽段负载型 MHC-Ig 和共刺激信号，则进入步骤 5。
- 向富集组分中加入表面包被共刺激信号的磁性颗粒，并施加磁场，使刺激信号在 T 细胞表面共聚集。
- 向富集组分中加入与颗粒上肽段负载型 MHC-Ig 数量等摩尔（或根据应用需求更高，参见 aAPC 特性调控部分）的刺激性抗体。
- 在 4 °C 条件下孵育 1 小时，使共刺激磁性颗粒与富集的 CD8+ T 细胞结合。
- 通过将培养板置于两个长度为 1.9 cm（0.75 英寸）的 N52 钕磁铁之间，施加磁场。
注意：N52 钕磁铁具有极强的磁场。储存时应使用隔片将磁铁分开，避免相互吸附；在放置于培养板上时也需小心操作，以免难以分离。为减少磁铁与培养箱金属部件之间的吸附，可将磁铁分别置于底部和顶部的 50 mL 圆锥管泡沫容器中。
2. 使用制备好的纳米颗粒人工抗原呈递细胞扩增并检测抗原特异性CD8+ T细胞
- 将含有aAPCs和CD8+ T细胞的96孔U型底板置于含5% CO2、37 °C、加湿的培养箱中培养3天。第3天时，每孔加入80 μL含2% TCGF的完全培养基进行换液，并将细胞放回培养箱继续培养至第7天。
- 第7天时，将刺激后的细胞收集至5 mL圆底离心管中进行细胞计数。
- 待所有溶液收集完毕后，离心收集的细胞，并用含0.05%叠氮化钠和2% FBS的0.5 mL PBS重悬。通过台盼蓝染色并在血细胞计数板上计数，确定活细胞数量。
- 取50,000–500,000个已计数的细胞，分别转移至两个新的5 mL圆底离心管中，用于抗原特异性染色。其中一管用于同源肽-MHC染色，另一管用于非同源染色以确定背景染色水平。
- 在100 μL含0.05%叠氮化钠和2% FBS的PBS中，向相应的同源和非同源管中各加入1 μg生物素标记的MHC-Ig，以及别藻红蛋白（APC）偶联的大鼠抗小鼠CD8a抗体（克隆号53-6.7，稀释比例1:100），4 °C孵育1小时。
- 加入二抗链霉亲和素及活死细胞染料。通过离心洗涤去除未结合的生物素化MHC-Ig。随后，所有样本在4 °C避光孵育15分钟，加入PE标记的链霉亲和素（1:350稀释）和可固定的绿色活死细胞染料（1:1000稀释）进行染色。
- 使用流式细胞仪检测所有样本，以确定抗原特异性及抗原特异性细胞的数量。
- 通过离心去除多余的二抗和活死染料，用含0.05%叠氮化钠和2% FBS的150 μL PBS缓冲液重悬细胞，上机进行流式细胞术检测。
- 使用数据分析软件确定抗原特异性细胞的数量和百分比。
- 为确定抗原特异性细胞的百分比，依次设置以下门控：活细胞阳性（live+）、淋巴细胞（前向散射 vs. 侧向散射）、CD8+、Dimer+。通过比较非同源与同源染色样本设定Dimer+门控范围。
- 通过从同源MHC-Ig染色样本的Dimer+百分比中减去非同源MHC-Ig染色样本的Dimer+百分比，计算出样本中抗原特异性细胞的实际百分比。
- 将该抗原特异性细胞百分比乘以实际计数的细胞总数，即可获得富集与扩增后产生的抗原特异性细胞数量。
注意：由于本实验所用荧光染料之间存在光谱重叠，需在流式细胞仪上正确设置补偿参数。