从小鼠腹腔分离原代肥大细胞的技术

摘要

来源：Tsvilovskyy, V.，等。腹膜来源肥大细胞的分离及其通过Ca²⁺成像和脱颗粒实验进行的功能表征。视觉化实验杂志 (2018)。

本视频演示了一种腹腔灌洗方法，用于从成年小鼠的腹腔中分离成熟的结缔组织型肥大细胞。在从腹腔中分离出原代免疫细胞混合物后，可在适当的培养条件下选择性地扩增肥大细胞。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 腹腔灌洗法分离PMC

1. 细胞分离前，准备好 表1 中列出的材料。
2. 使用 8 至 14 周龄的雄性小鼠进行腹膜巨噬细胞（PMC）分离。通过吸入 CO₂ 处死小鼠，并通过反射消失确认死亡。用 70% 乙醇喷洒小鼠，然后用针将其固定在泡沫板上（背侧朝下）。使用钝头剪刀去除小鼠腹侧皮肤，注意避免损伤腹膜腔。
   注意：本方案通常用于具有 C57BL/6N 品系遗传背景的小鼠。
3. 使用配备 27 G 针头的 10 mL 注射器，向腹膜腔内注射 7 mL 冰冷 RPMI 培养基和 5 mL 空气。将针头小心插入腹膜，避免刺穿任何器官。选择附睾脂肪区域的部位进针，以降低器官穿孔的风险。
4. 注射后，轻轻摇晃小鼠 1 分钟，使腹膜细胞脱落进入 RPMI 培养基中。摇晃力度不宜过大，以免损伤内脏器官并导致血液污染腹膜腔。
5. 将原 10 mL 注射器更换为新的 20 G 套管针。通过倾斜泡沫板并轻敲实验台面，将内脏器官移至一侧，以便从另一侧更方便地吸取液体。插入 20 G 针头（斜面朝上），缓慢轻柔地从腹部吸取液体（约 0.5 mL/s），避免因内脏堵塞而影响吸取。尽可能多地收集液体（通常为 5–6 mL）。
6. 将针头从注射器上取下，将收集的细胞悬液转移至预冷的收集管中。若发现明显血液污染，则弃去该样本管。
7. 将含有细胞悬液的管子在约 300 x g 条件下离心 5 分钟。在无菌操作台中吸去上清液。对每只小鼠，将沉淀物合并于 4 mL 冷（4–10 °C）PMC 培养基中，并将细胞悬液转移至 25 cm² 培养瓶中。加入生长因子 IL-3 和 SCF，使其终浓度分别为 10 ng/mL 和 30 ng/mL。将含细胞的培养瓶置于培养箱中（37 °C，5% CO₂），培养约 48 小时，直至进行下一步操作。

表1：步骤1所需材料。

1	冰
2	10 mL 注射器
3	27 G 针头
4	20 G 针头
5	泡沫塑料块和固定针
6	收集管（50 mL 塑料离心管）
7	70% 乙醇
8	RPMI 培养基（预冷并置于冰上保存）
9	PMC 培养基：RPMI 培养基 + 20% FCS（胎牛血清）+ 1% 青霉素-链霉素溶液（Pen-Strep）
10	Dulbecco 磷酸盐缓冲液 - DPBS（不含 Ca2+ 和 Mg2+）
11	培养瓶（25 cm）
12	生长因子储备液（IL-3：1 μg/μL；SCF：2.5 μg/mL）
13	血清移液管（10 mL）
14	无菌移液器吸头（20–200 µL）
15	血细胞计数板
16	台式离心机
17	剪刀和镊子
18	小鼠用 CO2 麻醉室
19	开放式无菌操作台
20	封闭式无菌操作台
21	细胞培养箱（37 °C 和 5% CO2）
22	移液器（20–200 µL）

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RPMI 培养基	Thermo Scientific	21875034
DPBS	Sigma-Aldrich	14190144
FCS	Thermo Scientific	R92157
IL-3	R&D Systems	403-ML
SCF	Thermo Scientific	PMC2115
青霉素-链霉素溶液（Penstrep）	Thermo Scientific	15140122
培养瓶（25 cm²）	Greiner Bio-One	69160
15 mL 塑料离心管	Sarstedt	6,25,54,502
台式离心机	Heraeus	Megafuge 1.0R