利用螺旋微流控通道从气管分泌物中无标记分离中性粒细胞

摘要

来源：Ryu, H., 等，利用闭环惯性微流控技术从患者来源的气道分泌物中无标记富集中性粒细胞。J. Vis. Exp. (2018)。

本视频展示了使用带有螺旋通道的微流控装置从气管分泌物中分离中性粒细胞的方法。该装置通过不同厚度和梯形截面的通道，依据细胞大小实现高效的分离。在多种力的共同作用下，较大的中性粒细胞聚集在内侧壁附近，而红细胞和黏蛋白聚集体则保留在外侧壁附近，从而确保中性粒细胞的有效分离。

方案

所有涉及人类参与者的操作均按照机构、国家和国际的人类福利指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审查。

1. 器件制备与软光刻技术

注意：采用标准的软光刻技术制备聚二甲基硅氧烷（PDMS）微通道。

1. 按10:1的基料与固化剂比例混合PDMS预聚物。
2. 将30 g PDMS预聚物混合物倒入微加工铝制模具中（尺寸见图1），将20 g PDMS预聚物混合物倒入100 mm培养皿中。
   注意： 培养皿用于制备较厚的PDMS薄膜（约3 mm），作为支撑层。PDMS支撑层可使微流控芯片具有均匀的物理表面特性。也可使用玻璃载片上的薄PDMS膜。具有特定通道尺寸的母模通过在铝板上进行微铣削加工设计和制造。本研究中使用的螺旋通道为8圈螺旋微通道，具有一个入口和两个出口，半径从8 mm增加至24 mm，以实现高效的基于尺寸的分离。
3. 将模具和培养皿放入真空干燥器中脱气，直至表面无可见气泡，通常需要5–10分钟。使用实验室真空泵为干燥器提供真空。
4. 释放真空，将模具和培养皿放入90 °C烘箱中加热1小时。
   注意： 可使用加热板或其他加热工具替代烘箱。
5. 从烘箱中取出模具和培养皿，在室温下冷却10分钟。
6. 使用2 mm打孔器小心地沿轮廓切割并打穿流体通路孔。
   注意： 打孔尺寸可根据管路或流体导管的尺寸进行调整。
7. 将胶带贴附在器件的通道面和PDMS厚膜上，用镊子小心剥离，以去除灰尘。
8. 对器件的通道面和普通PDMS表面进行空气等离子体处理，并与预先制备的普通PDMS支撑层键合（图1A）。
9. 将芯片放置在50 mm × 70 mm的玻璃载片上，并置于70 °C烘箱中至少30分钟，以增强键合强度。

2. 从机械通气患者收集气管分泌物

注意：可通过改良传统方法的方案，从接受机械通气的成年患者在常规气道护理期间获取气管分泌物。样本去标识化后立即送检处理。

1. 若需进行气管吸引，应使用导管抽取呼吸道分泌物。
2. 将导管小心送入气管插管至一半深度，然后从预装的10 mL注射器中注入5 mL的0.9%无菌生理盐水。
3. 当导管完全插入或遇到阻力时，吸引分泌物并将其收集至无菌痰液收集容器中。
4. 在无菌痰液容器中收集10 mL气管分泌物，并置于冰上。样本应立即送检进行处理。

3. 气管分泌物样本制备

注意：所有实验必须在生物安全柜中进行，并佩戴适当的个人防护装备。

1. 使用塑料10 mL注射器将1 mL呼吸道分泌物样本分散于9 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中（进行10倍稀释）。用钝头移液器将黏液样本均质化。
2. 用40 µm尼龙细胞滤网过滤稀释液，以去除大块物质或血凝块，防止其堵塞微流控装置的进样孔或通道。处理后将样本置于冰上。
3. 将每个样本的稀释液用100倍体积的PBS缓冲液进一步分散，得到1,000倍稀释的悬液。在整个解离操作过程中将样本置于冰上。

4. 实验设置

注意：所有实验必须在生物安全柜中进行，并佩戴适当的个人防护装备。

1. 组装PDMS芯片与流体导引装置，以向四个螺旋微通道施加均匀的流体流动（图1B）。
   注意：采用四个通道可通过并行操作提高通量，同时优化最终悬浮液的体积和细胞密度。流体导引装置采用立体光刻型3D打印机使用透明树脂设计和制造。流体导引装置的入口和出口端口采用雌性鲁尔接头，便于连接并在操作期间实现稳定密封。
2. 将1/16英寸雄性鲁尔接头连接至流体导引装置的入口、内壁（IW）出口和外壁（OW）出口端口，并将硅胶管连接至样品悬浮液。
3. 在入口和各个出口的两端插入平头接头，使其到达样品储液池底部。
4. 将蠕动泵与入口管路连接。
5. 将入口管路和内壁出口管路的末端置于样品储液池中，将外壁出口管路的末端置于废液储液池中（图1C, D）。
6. 将50 mL不含钙和镁的过滤PBS置于样品储液池中。
7. 以低流速（约1 mL/min）启动泵，对装置进行预灌注。
   注意：当通道中捕获气泡时，可用镊子轻压通道顶部，使气泡失稳并排除。当装置完全充满缓冲液后，更换PBS管，准备用于气道分泌物样品的管路。
8. 当样品置于样品储液池中后，开启蠕动泵并将流速设定为4 mL/min（图1C, D）。
9. 当样品体积达到指定体积（约1 mL）时，停止操作并断开硅胶管。
   注意：该方法在将大量稀释液（>50 mL）浓缩至微量离心管体积（约1 mL）方面具有更高效率（图2）。

结果

图1：螺旋微流控装置及实验设置。（A）螺旋微流控装置和（B）与流体适配器组装后的装置实物照片。（C）利用螺旋惯性微流控进行闭环分离的示意图。通过将颗粒/细胞富集流（IW出口）重新循环至原始样品储液池，免疫相关细胞被浓缩于小体积中，而含有黏蛋白聚集体和少量红细胞的背景液体则通过连接至OW出口的废液管持续排出。（D）实验装置图及10 µm颗粒的荧光图像、颗粒运动轨迹（绿色）和螺旋通道出口（右上角）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
PDMS预聚体	道康宁	184 SIL ELAST KIT 3.9KG	基础剂与固化剂 10:1 的比例
VWR 重力对流烘箱	VWR	414005-128	待固化的PDMS预聚物，90度
100毫米培养皿	VWR	89000-324	PDMS 支撑层的制备
Harris Uni-core 打孔器	Sigma-Aldrich	WHAWB100076	2毫米直径或其他尺寸，具体取决于导管大小
空气等离子机	飞秒科学	可爱	PDMS 装置与底部基底的表面等离子体处理
2" x 3" 载玻片	TED PELLA, INC.	2195	用于支撑PDMS装置
Masterflex 卷装铂金硫化硅胶管，L/S 14	Cole-Parmer	EW-96410-14	用于微流控和蠕动泵的管路
1/16 英寸鲁尔接头，雄性	哈佛仪器	PC2 72-1443	流体导引连接器
50 mL Falcon管	Corning	21008-940	样本采集 &amp；制备
不含钙和镁的1×磷酸盐缓冲液	康宁	45000-446 	用于稀释样品的缓冲液
Halyard 密闭吸痰导管，肘型，14F/通道 4.67 mm	HALYARD HEALTH	22113	气管分泌物吸痰导管
0.9% 无菌生理盐水，10 mL 预充式注射器	BD PosiFlush	NHRIC: 8290-306547	用于患者气管分泌物采集
SecurTainer™ III 型标本容器，20 mL	Simport	1176R36	无菌痰液（呼吸道分泌物）采集容器
带鲁尔锁扣针头的注射器，10 mL	BD	BD309604	用移液器吹打混匀黏液样本，并触及样本管底部
BD  钝头填充针，带 BD Luer-Lok 接头  提示	BD		用移液器吹打混匀黏液样本，并触及样本管底部
40µm 尼龙细胞筛 	Falcon	21008-949	为去除可能堵塞微流控装置进样孔或通道的大块组织或血凝块。
蠕动泵（Masterflex L/S Digital Drive）	Cole-Parmer	HV-07522-30	 微流控操作