利用螺旋微流控通道从气管分泌物中无标记分离中性粒细胞

摘要

来源：Ryu, H., 等，利用闭环惯性微流控技术从患者来源的气道分泌物中无标记富集中性粒细胞。J. Vis. Exp. (2018)。

本视频展示了使用带有螺旋通道的微流控装置从气管分泌物中分离中性粒细胞的方法。该装置通过不同厚度和梯形截面的通道，依据细胞大小实现高效的分离。在多种力的共同作用下，较大的中性粒细胞聚集在内侧壁附近，而红细胞和黏蛋白聚集体则保留在外侧壁附近，从而确保中性粒细胞的有效分离。

方案

所有涉及人类参与者的操作均按照机构、国家和国际的人类福利指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审查。

1. 器件制备与软光刻技术

注意：采用标准的软光刻技术制备聚二甲基硅氧烷（PDMS）微通道。

1. 按10:1的基料与固化剂比例混合PDMS预聚物。
2. 将30 g PDMS预聚物混合物倒入微加工铝制模具中（尺寸见图1），将20 g PDMS预聚物混合物倒入100 mm培养皿中。
   注意： 培养皿用于制备较厚的PDMS薄膜（约3 mm），作为支撑层。PDMS支撑层可使微流控芯片具有均匀的物理表面特性。也可使用玻璃载片上的薄PDMS膜。具有特定通道尺寸的母模通过在铝板上进行微铣削加工设计和制造。本研究中使用的螺旋通道为8圈螺旋微通道，具有一个入口和两个出口，半径从8 mm增加至24 mm，以实现高效的基于尺寸的分离。
3. 将模具和培养皿放入真空干燥器中脱气，直至表面无可见气泡，通常需要5–10分钟。使用实验室真空泵为干燥器提供真空。
4. 释放真空，将模具和培养皿放入90 °C烘箱中加热1小时。
   注意： 可使用加热板或其他加热工具替代烘箱。
5. 从烘箱....

结果

图1：螺旋微流控装置及实验设置。（A）螺旋微流控装置和（B）与流体适配器组装后的装置实物照片。（C）利用螺旋惯性微流控进行闭环分离的示意图。通过将颗粒/细胞富集流（IW出口）重新循环至原始样品储液池，免疫相关细胞被浓缩于小体积中，而含有黏蛋白聚集体和少量红细胞的背景液体则通过连接至OW出口的废液管持续排出。（D）实验装置图及10 µm颗粒的荧光图像、颗粒运动轨迹（绿色）和螺旋通道出口（右上角）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
PDMS预聚体	道康宁	184 SIL ELAST KIT 3.9KG	基础剂与固化剂 10:1 的比例
VWR 重力对流烘箱	VWR	414005-128	待固化的PDMS预聚物，90度
100毫米培养皿	VWR	89000-324	PDMS 支撑层的制备
Harris Uni-core 打孔器	Sigma-Aldrich	WHAWB100076	2毫米直径或其他尺寸，具体取决于导管大小
空气等离子机	飞秒科学	可爱	PDMS 装置与底部基底的表面等离子体处理
2" x 3" 载玻片	TED PELLA, INC.	2195	用于支撑PDMS装置
Masterflex 卷装铂金硫化硅胶管，L/S 14	Cole-Parmer	EW-96410-14	用于微流控和蠕动泵的管路
1/16 英寸鲁尔接头，雄性	哈佛仪器	PC2 72-1443	流体导引连接器
50 mL Falcon管	Corning	21008-940	样本采集 &amp；制备
不含钙和镁的1×磷酸盐缓冲液	康宁	45000-446 	用于稀释样品的缓冲液
Halyard 密闭吸痰导管，肘型，14F/通道 4.67 mm	HALYARD HEALTH	22113	气管分泌物吸痰导管
0.9% 无菌生理盐水，10 mL 预充式注射器	BD PosiFlush	NHRIC: 8290-306547	用于患者气管分泌物采集
SecurTainer™ III 型标本容器，20 mL	Simport	1176R36	无菌痰液（呼吸道分泌物）采集容器
带鲁尔锁扣针头的注射器，10 mL	BD	BD309604	用移液器吹打混匀黏液样本，并触及样本管底部
BD  钝头填充针，带 BD Luer-Lok 接头  提示	BD		用移液器吹打混匀黏液样本，并触及样本管底部
40µm 尼龙细胞筛 	Falcon	21008-949	为去除可能堵塞微流控装置进样孔或通道的大块组织或血凝块。
蠕动泵（Masterflex L/S Digital Drive）	Cole-Parmer	HV-07522-30	 微流控操作