一种体外诱导初始T细胞分化为产生GM-CSF的辅助性T细胞的技术

摘要

来源：Lu, Y., 等. 体外 小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）产生型辅助性T细胞的分化_HGM细胞 视频实验杂志 (2018).

本视频展示了粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）分泌型辅助性T细胞（T_HGM）的体外分化过程。分离得到的初始T细胞经刺激后分化为T_HGM细胞，通过检测细胞内高水平的GM-CSF产生以及低水平的其他辅助性T细胞特异性细胞因子表达，确认其分化成功。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 试剂与材料准备

1. 配制含有2%胎牛血清（FBS）和1 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的500 mL磷酸盐缓冲液（PBS）。
   注意：为获得最佳效果，整个操作过程中应将缓冲液置于冰上。
2. 配制50 mL完全RPMI培养基，包含RPMI 1640、10% FBS和1%青霉素-链霉素。在进行T_HGM细胞分化时，使用含有50 µM β-巯基乙醇的完全RPMI培养基。添加β-巯基乙醇时应在通风橱中进行。
3. 通过将抗CD3e浓缩液用PBS稀释至3 μg/mL，配制7.5 mL抗CD3e抗体混合液。向48孔板的每孔中加入150 μL抗体混合液以包被平板，并在37 °C孵育至少1小时，或在4 °C过夜孵育。
4. 将一把剪刀和镊子灭菌，并在每次解剖操作间隙将其保存于70%乙醇中。

2. 小鼠脾细胞的制备

1. 使用机构批准的 CO₂ 窒息法或颈椎脱位法处死小鼠（6–8 周龄）。用 70% 乙醇喷洒小鼠，并将其仰卧固定在聚苯乙烯板上。将小鼠转移至生物安全柜中，以进行后续操作。
2. 用镊子夹住皮肤，使用剪刀在左侧肋骨下方约 4 cm 处剪开皮肤。打开腹膜囊以暴露脾脏，并用无菌镊子取出脾脏。
3. 将 70 μm 细胞滤筛置于 50 mL 离心管上，并用 2 mL 缓冲液预润湿。将脾脏置于细胞滤筛上（每个滤筛放置 2–3 个脾脏），用 5 mL 注射器活塞末端研磨组织。
4. 用 1–2 mL 细胞分离缓冲液多次冲洗滤筛和离心管，直至所有细胞均被冲洗至管中。弃去细胞滤筛，将细胞在 4 °C 条件下以 350 x g 离心 5 分钟。弃去上清液。
5. 用 5 mL 冷（4 °C）氯化铵-氯化钾（ACK）裂解缓冲液（150 mM NH₄Cl，10 mM KHCO₃，0.1 mM Na₂EDTA；pH 7.2–7.4）重悬细胞沉淀，轻轻混匀 2 分钟。加入 10 mL 完全 RPMI 培养基以中和 ACK 缓冲液，立即在 4 °C 条件下以 350 x g 离心 5 分钟。离心后弃去上清液。

3. 使用磁性CD4微珠和细胞分离柱分离CD4⁺ T细胞

1. 将细胞沉淀重悬于 5 mL 细胞分离缓冲液中。使用预分离滤器（30 μm）将细胞悬液过滤至新的 15-mL 离心管中，以去除任何碎片。
2. 取 10 μL 细胞悬液，加入 90 μL 缓冲液进行 10 倍稀释。取 10 μL 稀释后的细胞悬液，与 10 μL 台盼蓝混合用于细胞计数。使用血细胞计数板对细胞进行计数，以确定活细胞的得率。
3. 在 4 °C 条件下，以 350 x g 离心 5 分钟，弃去上清液。
4. 按每 10⁷ 个细胞加入 90 μL 缓冲液的比例重悬细胞。按每 10⁷ 个细胞加入 10 μL 磁性 CD4 微珠的比例加入微珠。在 4 °C 条件下孵育 15 分钟。为获得最佳效果，孵育期间每 5 分钟轻轻混匀细胞悬液一次。
5. 在细胞孵育期间，将分离柱置于磁力架上，并用 2 mL 缓冲液预润湿柱子。
6. 细胞与微珠孵育结束后，用 5 mL 缓冲液洗涤细胞，在 4 °C 条件下以 350 x g 离心 5 分钟，弃去上清液。
7. 将细胞重悬于 1 mL 缓冲液中，将样品加载至细胞分离柱中，使其自然流过。使用 15-mL 离心管收集 CD4- 细胞组分。在储液室变干前，加入 1 mL 缓冲液洗涤一次。重复洗涤步骤 2 次。
8. 将细胞分离柱从磁力架上取下，置于新的 15 mL 离心管上。向细胞分离柱中加入 2 mL 细胞分离缓冲液，并用力插入推杆，将细胞从柱中推出。
9. 在 4 °C 条件下，以 350 x g 离心 5 分钟，获得 CD4⁺ 细胞。弃去上清液。

4. 通过荧光激活细胞分选法纯化初始CD4⁺ T细胞（CD4⁺CD25^-CD44^loCD62L^hi）及T_HGM分化

1. 重悬所获得的 CD4⁺ 用500 µL缓冲液重悬细胞沉淀，加入含CD4-PerCp（2.8 µg/mL）、CD44-APC（2.4 µg/mL）和CD25的荧光标记抗体混合物，混匀细胞。^-PE（2 µg/mL）和CD62L-FITC（10 µg/mL）（表1将细胞置于冰上孵育20–30分钟，期间避光。
   注意： 抗体的浓度已在实验室中预先优化。所列抗体数量适用于1–2只小鼠的细胞。
2. 孵育结束后，用 5 mL 缓冲液洗涤细胞，并在 350 x g 4 °C下离心5分钟。
3. 弃去上清液，将细胞重悬于500 µL缓冲液中。使用尼龙滤网再次过滤细胞。
4. 将细胞悬液转移至FACS管中用于细胞分选。预先在收集用FACS管中加入500 µL缓冲液进行预包被。
5. 获取 CD4⁺CD25^-CD44^loCD62L^你好 群体（初始CD4）⁺ T细胞）通过FACS分选。圈选CD4⁺CD25^- 首先，然后选择 CD44^loCD62L^你好 该群体中的细胞。
6. 分离初始CD4⁺ 将T细胞组分转移至新的15 mL离心管中。以350 x g离心细胞。 g 4 °C下离心5分钟，弃去上清液。
7. 重悬初始CD4⁺ 浓度为10⁶个细胞/mL的T细胞，置于含有50 µM β-巯基乙醇的完全RPMI培养基中。
8. 吸弃用于预包被48孔板的抗CD3e抗体。每孔接种0.25×10⁶个细胞（250 µL），并加入IL-7（2 ng/mL）、抗CD28（1 µg/mL）和抗IFNγ（10 µg/mL）表1).
   注意： 细胞因子和抗体的浓度此前已在实验室中针对T_HGM细胞分化
9. 在 37 °C、5% CO₂ 条件下培养细胞₂ 孵育期间3天内不更换培养基。

5. 小鼠T细胞分析_HGM细胞的生成 体外

1. 使用显微镜在分化后第3天观察细胞分化情况。收集细胞，以350 x g离心 g 4 °C下离心5分钟。用完全RPMI培养基洗涤细胞2次。
   注意： 分化后的细胞体积大于初始型CD4细胞⁺ T细胞
2. 将细胞重悬于1 mL完全RPMI培养基中。取10 μL细胞悬液，与10 μL台盼蓝充分混合，用血细胞计数板测定细胞数量。将分化后的细胞分为三份，用于再刺激和分析。
   注意： 细胞内细胞因子染色需要≥0.5×10⁶个细胞。
3. 对于细胞内细胞因子染色，使用佛波酯12-肉豆蔻酸13-乙酸盐（PMA）（100 ng/mL）和离子霉素（1 μg/mL）重新刺激细胞，并在蛋白转运抑制剂（1 µL/mL）存在的条件下孵育4–6小时。
   1. 收集细胞，加入抗CD4抗体（PerCP偶联，0.2 mg/mL，1:100稀释；或FITC偶联，0.5 mg/mL，1:100稀释），避光孵育30分钟。
   2. 使用200 μL固定缓冲液固定细胞20–60分钟。固定后，用1 mL破膜缓冲液洗涤细胞2次。
   3. 使用抗GM-CSF（PE标记，0.2 mg/mL，1:100稀释）、抗IL-17A（FITC标记，0.5 mg/mL，1:100稀释；APC标记，0.2 mg/mL，1:100稀释）、抗IL-4（APC标记，0.2 mg/mL，1:100稀释）和抗IFNγ（APC标记，0.2 mg/mL，1:100稀释；PE标记，0.2 mg/mL，1:100稀释）抗体在避光条件下进行细胞内染色，孵育30分钟。

表1：使用的细胞因子和抗体。

名称	储存浓度	工作浓度	稀释倍数	500 μL 染色缓冲液中的体积
CD4-PerCp	0.2 mg/mL	2.8 μg/mL	1:71	7 μL
CD44-APC	0.2 mg/mL	2.4 μg/mL	1:83	6 μL
CD25-PE	0.2 mg/mL	2 μg/mL	1:100	5 μL
CD62L-FITC	0.5 mg/mL	10 μg/mL	1:50	10 μL
GM-CSF-PE	0.2 mg/mL	2 μg/mL	1:100
IL-17A-FITC	0.5 mg/mL	5 μg/mL	1:100
IL-17A-APC	0.2 mg/mL	2 μg/mL	1:100
IFNγ-APC	0.2 mg/mL	2 μg/mL	1:100
IFNγ-PE	0.2 mg/mL	2 μg/mL	1:100
IL-4-APC	0.2 mg/mL	2 μg/mL	1:100
CD4-FITC	0.5 mg/mL	5 μg/mL	1:100
IL-7	20 μg/mL	2 ng/mL	1:10000
Anti-CD28	0.5 mg/mL	1 μg/mL	1:500
Anti-IFNγ	1 mg/mL	10 μg/mL	1:100

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RPMI 1640	Biowest	L0500-500
FBS 热灭活	Capricorn	FBS-HI-12A
青霉素-链霉素	Gibco	15140122
10x PBS	1st Base	BUF-2040-10	用无菌水稀释至1×PBS
EDTA	第一碱基	BUF-1053-100ml-pH8.0
10X ACK缓冲液	Biolegend	420301	用无菌水稀释
细胞筛	SPL Life Sciences	93070
CD4 微珠	Miltenyi Biotec	130-049-201
2-巯基乙醇	Sigma	M7522
LS 柱	Miltenyi Biotec	130-042-401
磁力架	Miltenyi Biotec	130-042-303
1 ml 注射器	Terumo	SS+01T
离心	Eppendorf	Eppendorf 5810R
索尼 SY3200 细胞分选仪	索尼	索尼 SY3200 细胞分选仪
50 ml 锥形离心管	Greiner Bio-One	210261
15 mL 圆锥形离心管	Greiner Bio-One	188271
FACS 管	康宁	352054
抗小鼠 CD4 PerCP-eFluor 710	eBioscience	46-0041-82
PE标记的抗小鼠CD25（IL-2Rα，p55）	eBioscience	12-0251-82
抗人/小鼠 CD44 APC	eBioscience	17-0441-82
抗小鼠 CD62L FITC	eBioscience	11-0621-85
改进型血细胞计数板	Marienfeld	640010
Hyclone 台盼蓝溶液	GE Healthcare Life Sciences	SV30084.01
显微镜	尼康	Nikon Elipse TS100
纯化的抗小鼠 CD3e 抗体	Biolegend	100314
纯化的仓鼠抗小鼠 CD28	BD 生物科学	553295
纯化的抗小鼠干扰素大鼠抗体γ	eBioscience	16-7312-85
纯化的抗小鼠 IL-4 抗体	Biolegend	504102
重组小鼠 IL-7 蛋白	R&D 系统	407-ML
PMA	默克密理博	19-144
Ionomycin	Sigma	I0634
高尔基体阻断剂蛋白转运抑制剂	BD 生物科学	51-2301KZ
细胞内固定&透化缓冲液套装	eBioscience	88-8824-00
抗小鼠 GM-CSF PE	eBioscience	12-7331-82
FITC 标记的抗小鼠 IL-17A 抗体	Biolegend	506908
APC 抗小鼠 IFN-γ	Biolegend	505810