一种体外诱导初始T细胞分化为产生GM-CSF的辅助性T细胞的技术

摘要

来源：Lu, Y., 等. 体外 小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）产生型辅助性T细胞的分化_HGM细胞 视频实验杂志 (2018).

本视频展示了粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）分泌型辅助性T细胞（T_HGM）的体外分化过程。分离得到的初始T细胞经刺激后分化为T_HGM细胞，通过检测细胞内高水平的GM-CSF产生以及低水平的其他辅助性T细胞特异性细胞因子表达，确认其分化成功。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 试剂与材料准备

1. 配制含有2%胎牛血清（FBS）和1 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的500 mL磷酸盐缓冲液（PBS）。
   注意：为获得最佳效果，整个操作过程中应将缓冲液置于冰上。
2. 配制50 mL完全RPMI培养基，包含RPMI 1640、10% FBS和1%青霉素-链霉素。在进行T_HGM细胞分化时，使用含有50 µM β-巯基乙醇的完全RPMI培养基。添加β-巯基乙醇时应在通风橱中进行。
3. 通过将抗CD3e浓缩液用PBS稀释至3 μg/mL，配制7.5 mL抗CD3e抗体混合液。向48孔板的每孔中加入150 μL抗体混合液以包被平板，并在37 °C孵育至少1小时，或在4 °C过夜孵育。
4. 将一把剪刀和镊子灭菌，并在每次解剖操作间隙将其保存于70%乙醇中。

2. 小鼠脾细胞的制备

1. 使用机构批准的 CO₂ 窒息法或颈椎脱位法处死小鼠（6–8 周龄）。用 70% 乙醇喷洒小鼠，并将其仰卧固定在聚苯乙烯板上。将小鼠转移至生物安全柜中，以进行后续操作。
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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RPMI 1640	Biowest	L0500-500
FBS 热灭活	Capricorn	FBS-HI-12A
青霉素-链霉素	Gibco	15140122
10x PBS	1st Base	BUF-2040-10	用无菌水稀释至1×PBS
EDTA	第一碱基	BUF-1053-100ml-pH8.0
10X ACK缓冲液	Biolegend	420301	用无菌水稀释
细胞筛	SPL Life Sciences	93070
CD4 微珠	Miltenyi Biotec	130-049-201
2-巯基乙醇	Sigma	M7522
LS 柱	Miltenyi Biotec	130-042-401
磁力架	Miltenyi Biotec	130-042-303
1 ml 注射器	Terumo	SS+01T
离心	Eppendorf	Eppendorf 5810R
索尼 SY3200 细胞分选仪	索尼	索尼 SY3200 细胞分选仪
50 ml 锥形离心管	Greiner Bio-One	210261
15 mL 圆锥形离心管	Greiner Bio-One	188271
FACS 管	康宁	352054
抗小鼠 CD4 PerCP-eFluor 710	eBioscience	46-0041-82
PE标记的抗小鼠CD25（IL-2Rα，p55）	eBioscience	12-0251-82
抗人/小鼠 CD44 APC	eBioscience	17-0441-82
抗小鼠 CD62L FITC	eBioscience	11-0621-85
改进型血细胞计数板	Marienfeld	640010
Hyclone 台盼蓝溶液	GE Healthcare Life Sciences	SV30084.01
显微镜	尼康	Nikon Elipse TS100
纯化的抗小鼠 CD3e 抗体	Biolegend	100314
纯化的仓鼠抗小鼠 CD28	BD 生物科学	553295
纯化的抗小鼠干扰素大鼠抗体γ	eBioscience	16-7312-85
纯化的抗小鼠 IL-4 抗体	Biolegend	504102
重组小鼠 IL-7 蛋白	R&D 系统	407-ML
PMA	默克密理博	19-144
Ionomycin	Sigma	I0634
高尔基体阻断剂蛋白转运抑制剂	BD 生物科学	51-2301KZ
细胞内固定&透化缓冲液套装	eBioscience	88-8824-00
抗小鼠 GM-CSF PE	eBioscience	12-7331-82
FITC 标记的抗小鼠 IL-17A 抗体	Biolegend	506908
APC 抗小鼠 IFN-γ	Biolegend	505810