Magnetic Isolation of Microglia from Mouse Pup Brains

doi:10.3791/30608

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Research Article

从小鼠幼崽大脑中磁性分离小胶质细胞

July 8, 2025

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Abstract

来源:Bokobza， C. et al.，从新生小鼠中磁性分离小胶质细胞用于原代细胞培养。J. Vis. Exp. （2022 年）

在本视频中，我们描述了一种使用磁激活细胞分选从小鼠幼崽大脑中分离 CD11b 细胞（包括小胶质细胞）的方案。将脑组织匀浆以获得单细胞悬液，将其与抗 CD11b 抗体包被的微珠一起孵育，然后进行基于磁柱的分离以纯化 CD11b + 细胞群。

Protocol

所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审查。

1. 脑解离和磁性小胶质细胞分离

注意:所有细胞作和重悬必须使用 1,000 μL 移液器进行，必须非常小心。施加高机械作用可能会激活或杀死小胶质细胞。

根据表 1，每个含有解离混合物的解离管转移 12 个脑块（~1.2 g）。对于 24 只幼崽，需要四个 C 管（图 1A-B）。
将 C 管放在分离器上（使用加热模式）。根据制造商的说明在设备中启动优化的 NTDK 程序（图 1D）。
以 300 x g 离心 20 秒（在 4 °C 下）以收集所有细胞。用 1,000 μL 移液器上下移液 3 次，完成机械解离（图 1E）。
将细胞转移到四个 15 mL 试管 + 过滤器中。用 10 mL 含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ （HBSS+/+）的 1x Hanks 平衡盐溶液（HBSS）冲洗过滤器（图 1F）。
以 300 x g 离心 10 分钟（在 4 °C 下）并去除上清液。用 10 mL HBSS + / + 小心重悬沉淀（图 1G）。
以 300 x g 离心 10 分钟（在 4 °C 下）并去除上清液。用 6 mL 分选缓冲液（1x PBS + 0.5% BSA）小心重悬沉淀（图 1H）。
以 300 x g 离心 10 分钟（在 4 °C 下）并去除上清液。每管加入 200 μL CD11b-微珠溶液并小心重悬（图 1I）。
将试管在 4 °C 下孵育 15-20 分钟。小心地用 6 mL 分选缓冲液重悬沉淀（图 1I-J）。
以 300 x g 离心 10 分钟（在 4 °C 下）并去除上清液。用 8 mL 的分选缓冲液小心地重悬沉淀（图 1K）。
按照分隔线上的 POSSEL 程序（参见材料表）准备八根柱子。在色谱柱上以 1 mL x 1 mL 的比例转移细胞。等待所有细胞通过后再添加另一 mL。在无菌洗脱板上用 1 mL 分选缓冲液洗脱 CD11b + 细胞（图 1L）。
将 CD11b + 细胞汇集在新的 50 mL 管中（图 1M）。
以 300 x g 离心 10 分钟（在 4 °C 下）并去除上清液。用 10 mL 冷小胶质细胞培养基（巨噬细胞无血清培养基（SFM） + 1% 青霉素-链霉素（P/S））小心重悬沉淀（图 1N）。
计数 CD11b + 细胞。在 P8 时，每个大脑应该获得 ~650,000 个细胞。
注意:在本方案中，使用自动细胞计数器对细胞进行计数（参见材料表）。
将细胞重悬于冷小胶质细胞培养基中，至终浓度为 650,000-700,000 个细胞/mL，并分装到细胞培养板中。
注意:6 孔板用于 Western 印迹（每孔 2 mL）;12 孔板用于 RT-qPCR 分析（每孔 1 mL），96 孔板用于吞噬测定（每孔 250 μL）。

表 1:解离混合物的制备。

<表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> 溶液 对于一个 C 管（μL） 用于四个 C 管（μL） 缓冲区 X 2850 元 11400 元酶 P（木瓜蛋白酶） 75 300 酶 A （DNAse） 15 60 缓冲区 Y 30 120 元总 2970 元 ¥11880

Representative Results

图 1
图 1:脑解离和小胶质细胞分离的示意图。（A-C）在 P8 小鼠脑解剖并去除嗅球和小脑后，首先将大脑转移到含有 HBSS+/+ 的培养皿中，然后转移到含有解离混合物的解离管中。将 C 管放在分离器上（具有加热模式），并启动 NTDK 程序（D）。（E）在程序结束时，将试管在 4 °C 下以 300 x g 离心 20 秒;然后用 1,000 μL 移液器上下移液 3 次完成解离。（F）然后将细胞转移至 15 mL 试管 + 70 μm 过滤器中，并用 10 mL HBSS+/+ 冲洗。（G）然后将样品在 4 °C 下以 300 x g 离心 10 分钟，除去上清液，并用 10 mL HBSS+/+ 重悬沉淀。（H）将试管在 4 °C 下再次以 300 x g 离心 10 分钟;除去上清液，然后将沉淀重悬于 6 mL 分选缓冲液中。（I）将试管在 4 °C 下以 300 x g 离心 10 分钟，除去上清液，加入 CD11b-微珠（200 μL）溶液。将试管在 4 °C 下孵育 15-20 分钟，然后重悬于 6 mL 分选缓冲液（J）中，并在 4 °C 下以 300 x g 离心 10 分钟。（K）除去上清液，将沉淀小心重悬于 8 mL 分选缓冲液中。（L）然后，在分隔线上启动 POSSEL 程序以准备色谱柱。在色谱柱上以 1 mL x 1 mL 转移细胞，并在无菌洗脱板上用 1 mL 分选缓冲液洗脱 CD11b 细胞。（M）将 CD11b 细胞混合在新的 50 mL 试管中，并在 4 °C 下以 300 x g 离心 10 分钟，并除去上清液。（N）在最后一步中，将沉淀小心地重悬于 10 mL 冷小胶质细胞培养基中。对细胞进行计数并在小胶质细胞培养基中稀释至终浓度为 650,000-700,000 个细胞/mL，分装在细胞培养板中。

Disclosures

No conflicts of interest declared.

Materials

<表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> 牛血清白蛋白 Miltenyi Biotec 公司电话:130-091-376 CD11b（小胶质细胞）微珠，h，m Miltenyi Biotec 公司电话:130-093-634 D-PBS （10 倍） Thermo Scientific 公司 14200067 Falcon 细胞培养 12 孔板，平底 + 盖子杜切尔 353043 Falcon 管 50 mL Falcon 管 50 mL 352098 神经组织解离试剂盒 - 木瓜蛋白酶 Miltenyi Biotec 公司电话:130-092-628 核计数器 NC-200 化学美泰 Nun EZFlip Top 锥形离心管 Thermo Scientific 公司 362694 OPTILUX 培养皿 - 100 x 20 mm 杜切尔 353003 gentleMACS C 管（4 x 25 管） Miltenyi Biotec 公司电话:130-096-334 带加热器的 gentleMACS Octo 分离器 Miltenyi Biotec 公司电话:130-096-427 汉克斯平衡盐溶液（HBSS） +CaCl2 +MgCl2 10x Thermo Scientific 公司 14065049 青霉素-链霉素（10 000 U/mL） Thermo Scientific 公司 15140122 巨噬细胞-SFM 无血清培养基 Thermo Scientific 公司 12065074 MACS BSA 原液 Miltenyi Biotec 公司电话:130-091-376 MACS SmartStrainer （70 μm），4 x 25 个 Miltenyi Biotec 公司 130-110-916 MultiMACS Cell24 分离器 Miltenyi Biotec 公司 Multi-24 列块 Miltenyi Biotec 公司电话:130-095-691

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