从小鼠幼崽大脑中磁分离小胶质细胞

摘要

来源：Bokobza, C. 等，从新生小鼠中磁分离小胶质细胞用于原代细胞培养。J. Vis. Exp. (2022)

在本视频中，我们介绍了一种利用磁珠激活细胞分选技术从小鼠幼崽脑组织中分离CD11b细胞（包括小胶质细胞）的实验方案。脑组织经匀浆处理以获得单细胞悬液，随后与包被抗CD11b抗体的磁珠共同孵育，再通过基于磁性柱的分离方法纯化CD11b+细胞群体。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 脑组织解离与磁珠法小胶质细胞分离

注意：所有细胞操作和重悬步骤必须使用1,000 µL移液器极其小心地进行。施加过强的机械作用可能激活或杀死小胶质细胞。

1. 根据表1，将12个脑组织块（约1.2 g）转移至含有解离混合液的解离管中。对于24只幼鼠，需要使用四个C管（图1A-B）。
2. 将C管放置于解离仪上（开启加热模式）。按照制造商说明，在设备中启动优化的NTDK程序（图1D）。
3. 在4 °C条件下以300 × g离心20秒，收集全部细胞。使用1,000 µL移液器上下吹打三次，完成机械解离（图1E）。
4. 将细胞转移至四个含细胞筛的15 mL离心管中。用10 mL含Ca²⁺和Mg²⁺的1×Hanks平衡盐溶液（HBSS+/+）冲洗细胞筛（图1F）。
5. 在4 °C条件下以300 × g离心10分钟，弃去上清液。用10 mL HBSS+/+小心重悬沉淀（图1G）。
6. 在4 °C条件下以300 × g离心10分钟，弃去上清液。用6 mL分选缓冲液（1×PBS + 0.5% BSA）小心重悬沉淀（图1H）。
7. 在4 °C条件下以300 × g离心10分钟，弃去上清液。每管加入200 µL CD11b磁珠溶液，并小心重悬（图1I）。
8. 在4 °C孵育15–20分钟。用6 mL分选缓冲液小心重悬沉淀（图1I-J）。
9. 在4 °C条件下以300 × g离心10分钟，弃去上清液。用8 mL分选缓冲液小心重悬沉淀（图1K）。
10. 按照分选仪（见材料表）上的POSSEL程序准备八个分选柱。将细胞以1 mL为单位逐次转移至分选柱上。每次需等待所有细胞完全通过后再加入下一份1 mL细胞悬液。使用1 mL分选缓冲液在无菌洗脱板中洗脱CD11b+细胞（图1L）。
11. 将CD11b+细胞收集至一个新的50 mL离心管中（图1M）。
12. 在4 °C条件下以300 × g离心10分钟，弃去上清液。用10 mL冷的小胶质细胞培养基（巨噬细胞无血清培养基（SFM）+ 1%青霉素-链霉素（P/S））小心重悬沉淀（图1N）。
13. 计数CD11b+细胞。在P8阶段，每只小鼠大脑应获得约650,000个细胞。
    注意：在本实验方案中，细胞计数使用自动细胞计数仪完成（见材料表）。
14. 将细胞重悬于冷的小胶质细胞培养基中，调整终浓度为650,000–700,000个细胞/mL，并分装至细胞培养板中。
    注意：6孔板用于Western Blot（每孔2 mL）；12孔板用于RT-qPCR分析（每孔1 mL）；96孔板用于吞噬功能检测（每孔250 µL）。

表1：解离混合液的配制。

溶液	一个 C-Tube 的用量（μL）	四个 C-Tube 的用量（μL）
Buffer X	2850	11400
Enzyme P (Papain)	75	300
Enzyme A (DNAse)	15	60
Buffer Y	30	120
总量	2970	11880

结果

图1：脑组织解离及小胶质细胞分离的示意图。（A-C）取出生后第8天（P8）小鼠脑组织，去除嗅球和小脑后，将脑组织首先转移至含HBSS+/+的培养皿中，随后转移至含有解离混合液的解离管中。将C管置于解离仪上（开启加热模式），并启动NTDK程序（D）。（E）程序结束后，于4 °C条件下以300 × g离心20秒；随后使用1,000 µL移液器轻轻吹打3次，完成组织解离。（F）将细胞转移至含70 µm细胞筛网的15 mL离心管中，并用10 mL HBSS+/+冲洗。（G）样本于4 °C条件下以300 × g离心10分钟，弃...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
牛血清白蛋白 	Miltenyi Biotec 	130-091-376
CD11b (小胶质细胞) MicroBeads，人源，鼠源	Miltenyi Biotec	130-093-634
D-PBS (10倍浓缩)	Thermo Scientific	14200067
Falcon 细胞培养12孔板，平底 + 盖	Dutscher 	353043
Falcon 50 mL 离心管	Falcon tubes 50 mL	352098
神经组织解离试剂盒 - 木瓜蛋白酶	Miltenyi Biotec 	130-092-628
Nucleocounter NC-200 	Chemometec
Nun EZFlip Top 锥形离心管	Thermo Scientific 	362694
OPTILUX 培养皿 - 100 × 20 mm 	Dutscher 	353003
gentleMACS C 管 (4 × 25 支)	Miltenyi Biotec	130-096-334
gentleMACS Octo 解离仪（带加热模块）	Miltenyi Biotec	130-096-427
Hanks' 平衡盐溶液 (HBSS) +CaCl₂ +MgCl₂ 10倍浓缩	Thermo Scientific	14065049
青霉素-链霉素 (10,000 U/mL)	Thermo Scientific 	15140122
巨噬细胞-SFM 无血清培养基	Thermo Scientific	12065074
MACS BSA 储存液	Miltenyi Biotec	130-091-376
MACS SmartStrainer 过滤筛 (70 μm)，4 × 25 个	Miltenyi Biotec	130-110-916
MultiMACS Cell24 分离器	Miltenyi Biotec
Multi-24 柱架	Miltenyi Biotec	130-095-691