通过脑池内递送脑膜炎奈瑟菌至小鼠模型以诱导脑膜炎奈瑟菌性脑膜炎

摘要

来源：Pagliuca, C.，等，通过小脑池注射诱导小鼠C群脑膜炎球菌性脑膜炎。J. Vis. Exp. (2019)

在本视频中，我们演示了将脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis）通过小脑延髓池注射的方式递送至小鼠模型，以建立脑膜炎感染模型。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 小鼠脑池内注射

注意：整个操作过程均在层流柜中进行，以维持无菌条件。

1. 在特定无病原体条件下饲养实验室小鼠（8周龄，雌性Balb/c），提供颗粒饲料和水 随意摄取.
2. 在开始实验前，将动物置于新环境中适应1周。
3. 实验开始前，称重并测量其体温。
   注意： 八周龄的近交系Balb/c雌性小鼠平均体重约为19 g。实验小鼠的生理体温正常范围为36–38 °C。
4. 用手指捏住动物颈部皮肤，以70%乙醇清洁腹部区域，使用25 G（0.5 mm × 16 mm）针头在小鼠腹部右下象限进行腹腔注射铁右旋糖酐（溶于1%磷酸盐缓冲液，250 mg/kg），注射时间约为感染前2–3小时。
   注意： 在小鼠腹部右下象限进行腹腔注射，以避免损伤膀胱、盲肠等腹腔器官。在感染前向动物给予外源性铁剂（以右旋糖酐铁形式）可促进细菌在宿主体内的增殖。
5. 2–3 小时后，使用氯胺酮（50 mg/kg）和赛拉嗪（3 mg/kg）对动物进行麻醉，并使用眼用润滑剂。
6. 通过捏压脚趾以确认无疼痛反应，检查麻醉深度。
7. 将小鼠置于仰卧位，轻轻拉伸其四肢和颈椎，以保持脊柱处于直线位置。
8. 轻轻混匀细菌悬液，以保持悬浮状态均匀，然后用30 G针头（8 mm）的注射器吸取悬液。
   注意： 尽量在注射前配制细菌悬液，同时将其置于室温下保存。
9. 根据解冻后的细菌滴度（CFU/mL），结合拟感染动物总数，计算所需使用的总CFU数（每只动物的细菌接种剂量 × 动物数量）。通过解冻后细菌滴度（CFU/mL）与用于感染n只小鼠的总CFU数之间的比例关系，计算从冻存管中应取用的确切体积（即：解冻后细菌滴度 CFU : 1 mL = 总CFU : x mL）。根据拟感染动物总数确定最终接种体积。
   注意： 在这些实验中，滴度范围广泛，从10⁴ 至 10⁹ 每只动物
10. 用70%乙醇清洁手术区域。
11. 借助针头确定注射位点，使用30 G × 8 mm针头经枕骨钻孔，向小鼠小脑延髓池内注射已知菌落形成单位（CFU）的脑膜炎奈瑟菌（野生型菌株及等基因突变株），或作为对照的含铁右旋糖酐（5 mg/kg）的GC肉汤，总体积为10 µL。
    1. 在颅颈交界处进行小脑延髓池接种，将针头置于背侧蛛网膜下腔。屈曲头部以暴露该区域。
    2. 简而言之，将动物置于侧卧位，将耳朵移开，适度屈曲颈部（90至100°）。确保颈部中线与头部（从鼻部至枕部）完全平行于操作台面。
    3. 触碰寰椎翼并确保其重叠，以消除轴向旋转。通常可在中线上触及一个自然凹陷，此处最可能是针头进入枕骨大孔的位置。
    4. 注射小鼠后，将注射器和针头安全丢弃 奈瑟菌属.
12. 将动物放入笼中，等待其苏醒并完全恢复运动能力。
13. 将感染小鼠的笼子置于层流柜中。
14. 感染后24小时监测小鼠是否出现昏迷的临床症状，依据昏迷评分标准进行评估。昏迷评分标准：1分 = 昏迷，2分 = 翻转至背部后无法直立站立，3分 = 翻转至背部后30秒内能够直立站立，4分 = 翻转至背部后5秒内能够直立站立，活动量轻微，5分 = 正常。
    注意： 当动物出现疼痛时，给予美洛昔康镇痛（5 mg/kg，腹腔注射，持续至研究结束）。

2. 动物存活率与菌落形成单位计数

1. 动物存活率
   1. 制备不同剂量的细菌接种物（范围为每只小鼠 10⁴ 至 10⁹ CFU），通过脑池内（i.cist.）途径感染动物。
   2. 以相同方式，用添加右旋糖酐铁（5 mg/kg）的 GC 肉汤接种对照组小鼠。
   3. 每天至少两次监测动物的临床症状：毛发竖立、蜷缩姿态、低体温、体重减轻、嗜睡或濒死状态，整个实验持续至少 168 小时（7 天）。
   4. 每天使用电子天平和直肠温度计分别测量小鼠的体重和体温。
   5. 记录小鼠一周内的存活情况。
      注意：记录感染后自然死亡的动物；达到昏迷评分为 2 或观察时间超过 168 小时的动物将被实施安乐死。
   6. 对昏迷评分为 2 或观察时间超过规定时限的小鼠，使用氯胺酮（50 mg/kg）和赛拉嗪（3 mg/kg）进行麻醉，并涂抹眼用软膏。
   7. 通过脚趾夹捏测试确认疼痛反应消失。
   8. 通过颈椎脱位法对小鼠实施安乐死，并在统计分析中记录为死亡。
   9. 对感染动物继续进行动物存活率或菌落形成单位（CFU）计数检测。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
报警温度计	TESTO	9000530	设备
BD 微细胰岛素注射器	BD	320837	U-100 胰岛素
BD Plastipak 注射器 1ml 25GA 5/8英寸	BD	300014	05x16mm
BD Plastipak 注射器 5ml	BD	308062	07 x 30mm
BIOHAZARD AURA B 垂直层流生物安全柜	Bio Air s.c.r.l.	Aura B3	设备
C150 CO2 培养箱	Binder	9040-0078	设备
标准饲料认证	Mucedola s.r.l.	4RF21	动物用颗粒饲料
Dumont Hp 镊子 5号 不锈钢	F.S.T. by DUMONT	AGT5034	尖端尺寸 0.10 x 0.06 mm
电子天平	Gibertini	EU-C1200	最大称量 1200g，d=0.01g，T=-1200g
右旋糖酐铁溶液	Sigma-Aldrich	D8517-25ML
氯胺酮	Intervet
微生物安全柜 BH-EN 和 BHG II 级	Faster	BH-EN 2004
微量离心管 1.5ml	BRAND	PP780751	螺口聚丙烯管，带刻度
小鼠操作镊	F.S.T.	11035-20	带锯齿橡胶头；夹持面：15 x 20 mm
天然乳胶手套	Medica	M101
Touch N Tuff 一次性丁腈手套	Ansell	92-500
赛拉嗪	Intervet