监测小鼠感染模型中中性粒细胞募集动态及细菌负荷

摘要

来源：Anderson, L. S., 等. 一种用于评估对Staphylococcus aureus感染先天免疫反应的小鼠模型. J. Vis. Exp. (2019)。

本视频演示 体内 利用成像技术研究免疫缺陷型转基因小鼠感染部位中表达GFP的中性粒细胞的募集动态。该方法包括注射发光细菌以引发感染，进而诱导中性粒细胞向感染部位募集，并通过成像技术对其进行追踪。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 小鼠来源与饲养

1. 在 C57BL/6J 遗传背景下培育 LysM-eGFP 小鼠。通过将 C57BL/6J 背景的 LysM-EGFP 小鼠与 MyD88^-/- 小鼠杂交，获得 LysM-EGFP×MyD88^-/- 小鼠。
2. 将小鼠饲养于动物实验设施中。在本研究中，动物术前于加利福尼亚大学戴维斯分校以群养方式饲养，术后单笼饲养。使用年龄在 10–16 周之间的小鼠。

2. 细菌制备与定量

1. 移除生物发光信号 S. aureus 从-80 °C保存条件下取出目标菌株，在冰上解冻。在5%牛血琼脂平板上划线接种。将划线后的平板置于37 °C湿润培养箱中过夜（16 h）培养。
   注意： 在本实验方案中，使用了 ALC2906 SH1000 菌株。该菌株含有穿梭质粒 pSK236，其上带有与青霉素结合蛋白 2 启动子融合的 luxABCDE 报告基因盒从 Photorhabdus luminescens.
2. 将胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）粉末按每毫升纯水加入0.03 g的比例溶解，混匀后经高压灭菌以灭菌。冷却后，采用无菌操作技术加入所需的抗生素。在本实验方案中，向TSB中加入终浓度为10 µg/mL的氯霉素，以筛选含有生物发光luxABCDE基因盒的pSK236穿梭质粒的表达。
3. 从平板上挑取3-4个独立的菌落 S. aureus 将菌株接种于含 10 µg/mL 氯霉素的 TSB 培养基中，开始过夜培养。将细菌置于 37 °C 摇床培养箱中孵育过夜（16 h）。
4. 从过夜培养物中取样，按1:50比例接种于含10 µg/mL氯霉素的TSB培养基中，启动新的细菌培养。在37 °C、200 rpm条件下于恒温振荡摇床中培养。
5. 分盘后两小时 S. aureus，监测 600 nm 处的光密度（OD₆₀₀在分光光度计上测量吸光度（OD）。观察 OD 值₆₀₀ 与时间的关系以确定对数中期生长阶段。对于 ALC2906 SH1000 菌株，OD₆₀₀ 0.5 处于对数中期，对应浓度为 1 x 10⁸ CFU/mL图1).
6. 当OD₆₀₀ 为0.5时，用预冷的DPBS以1:1比例洗涤细菌。在3,000 x g条件下离心细菌10分钟 g 以及 4 °C。小心倾去上清液，加入额外的预冷 DPBS 并充分涡旋。再次以 3,000 x g 离心 10 分钟 g 和 4 °C。
7. 小心倾去上清液。将细菌沉淀重悬于所需浓度的溶液中。在本研究中，收集 3 mL ALC2906 SH1000，重悬于 1.5 mL PBS 中，对应细菌浓度约为 2 × 10⁸ CFU/mL。使用前将细菌置于冰上保存。
8. 为验证细菌浓度，将100 µL细菌样品用PBS分别稀释1:10,000和1:100,000。取20 µL稀释液接种于琼脂平板上。在37 °C湿润培养箱中培养16 h。通过肉眼观察计数菌落形成单位（CFU），并于次日计算细菌浓度。

3. 切除性皮肤伤口制备及接种 S. aureus

1. 向每只小鼠注射 100 µL 浓度为 0.03 mg/mL 的盐酸丁丙诺啡溶液（约 0.2 mg/kg） 通过 腹腔注射
2. 注射后20分钟，将2-4只小鼠放入麻醉舱中，使用2-3 LPM氧气混合2-4%异氟烷进行麻醉。待小鼠完全麻醉后，逐只转移至连接有2-3 LPM氧气混合2-4%异氟烷的鼻罩装置中。通过用拇指和食指用力夹捏每只后肢足垫来确认小鼠是否完全麻醉。若小鼠对夹捏无反应，则进行下一步操作。
3. 用电动剪毛器在小鼠背部剃除一块1英寸×2英寸的区域，并用干净的擦拭纸或纱布清除剪下的毛发。避免使用脱毛乳液，因其可能引起过度炎症。
4. 先用含10%聚维酮碘的纱布清洁小鼠背部，再用含70%乙醇的纱布擦拭。以手术区域中心为起点，按螺旋方式向外周清洁。手术前等待约1分钟，使手术区域完全干燥。
5. 用两根手指轻轻夹住小鼠背部剃毛区域，将无菌的6 mm打孔活检器在已准备好的手术区域中心用力按压。切勿拉紧皮肤。
   1. 旋转皮肤钻孔活检工具，在皮肤上形成一个环形切口，确保至少在切口的某一处完全穿透皮肤。注意不要切到深部的筋膜或组织。
   2. 使用无菌剪刀和镊子，沿穿刺活检留下的圆形印迹切开表皮和真皮。

4. S. aureus 接种

1. 用28 G胰岛素注射器吸取所需浓度的生物发光细菌接种物。本研究中，接种浓度为1 × 10⁸ CFU/mL（50 µL）。注射体积不得超过100 µL。
2. 将50 µL接种物注射至小鼠背部伤口中心处的筋膜与组织之间。确保接种物在伤口中心形成气泡，且无明显泄漏或扩散。
   1. 将皮肤向一侧牵拉，持注射器几乎与组织平行，缓慢刺入组织，直至阻力突然降低，表明已穿透筋膜。小心将注射器引导至伤口中心，缓慢注入接种物。随后缓慢将注射器从动物体内抽出。
3. 对未感染动物的伤口，按上述方法注射相同体积的无菌PBS。
4. 将动物放回笼中，将笼子置于加热灯下或加热垫上，并在动物恢复意识前持续监测其状态。

5. 体内生物发光成像与荧光成像

1. 通过仪器软件启动整只动物成像仪。将小鼠置于麻醉舱中，以每分钟2-3升氧气流速并含2-4%异氟烷进行麻醉。通过成像仪内的鼻罩输送麻醉气体。
2. 将受伤并感染的小鼠放入成像仪中，调整小鼠位置，使伤口尽可能平展。按照以下序列设置对小鼠进行成像。
   1. 选择生物发光和拍照作为成像模式。曝光时间为1分钟，采用小像素合并模式，光圈F/stop 1（生物发光）和F/stop 8（拍照）。发射滤光片设置为开放。点击采集按钮以记录图像。
   2. 选择荧光和拍照作为成像模式。曝光时间为1秒，采用小像素合并模式，光圈F/stop 1（荧光）和F/stop 8（拍照），激发波长为465/30 nm，发射波长为520/20 nm，并使用高亮度光源。点击采集按钮以记录图像。
3. 将动物放回笼中，并在麻醉恢复期间持续监测。
4. 按照上述方法每日对小鼠进行成像。

6. 图像分析

1. 打开待定量分析的图像。
2. 在图像中每只小鼠的整个伤口区域（包括周围皮肤）上放置一个较大的圆形兴趣区域（ROI）。中性粒细胞体内FLI EGFP信号及 体内 生物发光成像 S. aureus 信号在数天后延伸至伤口边缘之外，并被纳入本研究中（图2A 和 2B）。点击 测量 ROI 记录每只小鼠的平均通量值，并绘制每个信号的平均通量（p/s）曲线 与 时间
3. 如果中性粒细胞的绝对数量或 S. aureus 若需在伤口中实现上述效果，请进行以下实验。
   1. 为了将中性粒细胞数量与体内的 FLI EGFP 信号相关联，按照上述方法对 C57BL/6J 小鼠进行伤口处理，并移植一系列骨髓来源的中性粒细胞（5 × 10⁵ 至 1 × 10⁷来自 LysM-EGFP 或 LysM-EGFPxMyD88^-/- 将供体直接置于不同伤口上方。按上述方法成像并进行相关分析 体内 FLI EGFP信号对应已知数量的中性粒细胞。
   2. 为了关联 S. aureus 菌落形成单位到 体内 BLI信号检测、造伤及感染小鼠操作如上所述。感染后第1天，记录小鼠体内BLI信号，随后立即处死并冷藏尸体。切除伤口组织，匀浆处理，将细菌稀释液接种于琼脂平板，过夜培养。次日计数菌落，确定每处伤口的CFU。
4. 通过在伤口边缘拟合一个圆形感兴趣区域（ROI），测量伤口面积（cm²）并绘制相对于基线的分数变化随时间的变化曲线（图2C).

结果

图1：OD之间的相关性₆₀₀ 以及 ALC2906 的 CFU 计数。 从琼脂平板上挑取3-4个ALC2906 SH1000菌落，转移至含10 µg/mL氯霉素的TSB培养基中过夜培养。次日，将菌液按1:50比例分装至含10 µg/mL氯霉素的TSB培养基中继续培养。于600 nm波长处测定光密度（OD₆₀₀) 在2小时后定期使用分光光度计测定。每次测定时，将细菌用预冷的PBS稀释1:100,000，分装至琼脂平板，过夜培养。次日计数菌落形成单位（CFU），以计算初始浓度，并与OD相关联₆₀₀n = 3...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
14 mL 聚丙烯圆底管	Falcon	352059
6mm 一次性活检穿孔器	Integra Miltex	33-36
生物发光 S. aureus	Lloyd Miller，约翰斯·霍普金斯大学	ALC 2906 SH1000
5% 牛血琼脂，Hardy Diagnostics	VWR	10118-938
盐酸丁丙诺啡注射液	西方医疗用品公司	7292	0.3 mg/mL
C57BL/6J 小鼠	杰克逊实验室	664
氯霉素（结晶粉末）	Fisher BioReagents	BP904-100
DPBS (1X)	Gibco	14190-144
胰岛素注射器	Becton, Dickson and Company	329461	0.35 mm（28 G）× 12.7 mm（1/2″）
IVIS Spectrum 在体实验 成像系统	Perkin Elmer	124262
Living Image 软件 – IVIS Spectrum 系列	Perkin Elmer	128113
LysM-eGFP 小鼠	Thomas Graff 阿尔伯特·爱因斯坦医学院，纽约	NA
微量分光光度计	ThermoFisher Scientific	ND-2000
MyD88 基因敲除小鼠	杰克逊实验室	9088
无纺海绵	AMD- Ritmed 公司	A2101-CH	5 cm × 5 cm
聚维酮碘 10% 溶液	Aplicare	697731
胰蛋白胨大豆肉汤	Becton, Dickson and Company	211825