一种在小鼠模型中诱导眼表炎症的方法

摘要

来源：Singh, J.，等. 眼表炎症的诱导及受累组织的采集。J. Vis. Exp. (2022)

本视频展示了一种在小鼠模型中诱导眼表炎症和睑板腺功能障碍的方法。通过使用免疫原刺激小鼠免疫系统，并在后期用相同免疫原再次刺激，可促进眼表炎症的发生，导致中性粒细胞产生的aggNETs堵塞睑板腺分泌物，进而引发干眼症。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 小鼠眼表炎症的诱导

1. 进行免疫原制备以实施免疫。
   1. 在免疫当天新鲜配制免疫原，将卵清蛋白（OVA，50 mg/mL）和百日咳毒素（100 µg/mL）溶于生理盐水，并与佐剂氢氧化铝（40 mg/mL）（参见材料表）按1:1比例混合。
      注意：百日咳毒素的开启、重悬及免疫原配制操作必须在层流安全柜中进行。操作时应穿戴防护服，避免与皮肤接触。
   2. 将免疫原与佐剂混合物在室温下孵育30分钟，然后将100 µL混合液装入1 mL注射器中。
   3. 对未麻醉的小鼠进行腹腔内注射免疫原溶液。
      1. 用一只手握住鼠尾并抓住笼盖网格，用拇指和食指牢固夹住小鼠背部和颈部皮肤，同时将尾部及后肢固定于无名指与小指之间，并紧贴手掌。
      2. 保持固定后的小鼠头部朝下。
      3. 将100 µL已配制的免疫原溶液注射至下腹部腔体的右侧或左侧象限。
2. 免疫后2周进行眼表激发。
   1. 使用异氟烷（2.5%）对小鼠进行麻醉。
   2. 每只眼睛滴加5 µL OVA（50 mg/mL）或生理盐水（0.9% NaCl），双侧眼睛均需处理，等待滴眼液被眼球吸收，约需5分钟。
   3. 每日重复该操作1次，连续7天。
      注：药物的局部给药可采用相同方式进行。

2. 眼部分泌物的采集

1. 在攻毒后立即向眼内滴加50 µL无菌生理盐水，收集攻毒阶段形成的眼部分泌物。

3. 眼表组织的切除

1. 按照以下步骤解剖眼睑和眼球。
   1. 采用 CO₂ 窒息法处死小鼠，随后进行颈椎脱位。
   2. 将小鼠置于平坦的表面上。
   3. 用浸有70%乙醇的棉签消毒眼部周围的眶区。
   4. 在耳部与眶后窦之间做切口，并沿鳞状骨上方垂直切开，再沿上颌骨下缘水平延伸切口至下眼睑下方，同时沿额骨上缘水平延伸至上眼睑上方，从而形成围绕眼球的环形切口（图1）。
   5. 使用弯头镊子小心夹住眼部周围已解剖的组织，轻轻拉出组织和眼球。
   6. 将切除的器官置于无菌 PBS 中。
   7. 在体视显微镜下，使用手术刀修剪上眼睑周围多余的面部肌肉组织。
2. 按照以下步骤收集结膜。
   1. 将上眼睑置于体视显微镜下的干燥培养皿中。
   2. 使用精细镊子和手术刀，从眼睑内表面极其轻柔地剥离出白色黏膜层。
3. 接下来，按照以下步骤解剖角膜。
   1. 将眼球置于盛有干冰的新干燥培养皿上，冷冻3分钟。
   2. 将培养皿平稳地移至实验台面。
   3. 使用精细锐利的剪刀，在角膜边缘靠近角巩膜缘处做一小切口。
   4. 用手术刀沿眼球继续延长切口，使巩膜与角膜分离。
   5. 用大量生理盐水冲洗角膜背面，清除残留的虹膜和晶状体。

结果

图1：眶周面部组织的切除。 切口路径以红色标示。该操作可实现眼球器官的切除，并用于研究各种局部给药治疗手段对结膜、角膜等附属眼器官的影响及作用效果。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1× PBS	Gibco
氢氧化铝	Imject alum Adjuvant	77161	40 mg/mL 终浓度：体内：1 mg/100 µL
7–9 周龄 C57Bl/6 小鼠	Charles River Laboratories
弯镊	FST by Dumont SWITZERLAND	5/45 11251-35
精细尖头剪刀	FST 不锈钢，德国	15001-08
层流安全柜	Herasafe
0.9% 氯化钠（生理盐水）	B.Braun
卵清蛋白（OVA）	Endofit, Invivogen	9006-59-1	生理盐水中 10 mg/200 µL
百日咳毒素	ThermoFisher Scientific	PHZ1174	生理盐水中 50 µg/500 µL 终浓度：体内：100 µg/100 µL
培养皿	Greiner bio-one	628160
手术刀	Feather 一次性手术刀	No. 21	终浓度：体内：300 ng/100 µL
体视显微镜	Zeiss	Stemi508
注射器（角膜/虹膜冲洗）	BD Microlane	27 G x 3/4 - Nr.20 0,4 x 19 mm
注射器（腹腔免疫）	BD Microlane	24 G1"-Nr 17, 055* 25 mm