来源：Chen, E. W., 等. T细胞受体信号转导介质的鉴定 通过 化学抑制剂文库的筛选 J. Vis. Exp. (2019).
在本视频中，我们介绍了一种用于鉴定可调节自身反应性CD4+CD8+双阳性未成熟胸腺细胞凋亡的小分子激酶抑制剂的方法。通过使用包被抗CD3和抗CD28抗体的磁珠激活双阳性胸腺细胞以诱导其凋亡；随后进行小分子抑制剂处理，并利用流式细胞术分析来检测这些抑制剂是否调节凋亡标志物的表达。
方法文章
鉴定可调节胸腺细胞对强TCR信号反应的激酶抑制剂
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2025年7月8日
本文内容
摘要
方案
所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。
1. 激酶抑制剂文库筛选（无需离心的检测方法）
- 使用激酶抑制剂处理胸腺细胞
- 制备胸腺细胞悬液。
- 用完全RPMI培养基稀释胸腺细胞，获得浓度为25 × 106 个细胞/mL的胸腺细胞悬液。
- 使用多通道移液器将40 μL胸腺细胞悬液加入低体积培养板的每孔中，并将培养板置于冰上。
- 在完全RPMI培养基中稀释储存板中的抑制剂、DMSO和地塞米松，按4份完全RPMI与1份抑制剂/DMSO/地塞米松的比例进行稀释（稀释倍数为5）。
注意：由于本实验所用低体积培养板的体积仅为常规方法的1/5，因此在加入培养板中的胸腺细胞前，需先将抑制剂和对照试剂稀释5倍。 - 从步骤1.1.4制备的抑制剂板相应孔中，向96孔板每孔加入0.5 μL激酶抑制剂。
- 设置8个未处理对照孔；通过加入步骤1.1.4中制备的0.5 μL DMSO，设置4个溶剂对照孔；使用步骤1.1.4中稀释后的地塞米松，设置4个5 μM地塞米松处理对照孔（图1）。
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结果
图1：胸腺细胞激活实验的孔板布局。 （顶部）第1列和第12列保留用于对照，第2至第11列为小分子抑制剂处理的样品（米色）。阴性对照（未刺激组 [NS]；灰色）占据A1至D1孔，细胞死亡阳性对照（地塞米松处理组 [DEX]；紫色）占据E1至H1孔。第2至第12列包含经抗CD3/CD28磁珠刺激的胸腺细胞。胸腺细胞激活的阳性对照（刺激组 [α-CD3/CD28]；绿色）占据A12至D12孔，溶剂对照（刺激并DMSO处理组 [α-CD3/CD28 + DMSO]；红色）占据E12至H12孔。（底部）在双阳性（DP）门内圈选的胸腺细胞中，活化型caspase-3（ActCasp3）、CD69和TCRβ染色的流式细胞术图谱。展示了不同对照组的代表性图谱。NS = 未刺激样本；DEX = 地塞米松处理样.......
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| RPMI | HyClone | SH30027FS | |
| FBS | HyClone | SH3007103 | |
| L-谷氨酰胺 | HyClone | SH3003401 | |
| 丙酮酸钠 | HyClone | SH3023901 | |
| 10X PBS | Vivantis | PB0344 – 1L | |
| 激酶筛选文库（96孔） | Cayman Chemical | 10505 | 文库的具体成分可能有所不同 |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
| 地塞米松 | Sigma Aldrich | D4902 | |
| 抗CD3/CD28磁珠 | Thermo Fisher Scientific | 11452D | |
| FITC 活化型 Caspase-3 凋亡检测试剂盒 | BD Pharmingen | 550480 | 包含固定/破膜缓冲液、10倍稀释的破膜/洗涤缓冲液以及抗caspase 3抗体 |
| DA-Cell Washer | CURIOX | HT1000 | |
| 96孔DA-细胞板 | CURIOX | 96-DC-CL-05 | |
| 抗体 | |||
| CD3ε | BioLegend | 100236 | |
| TCRβ | BD 生物科学 | 553174 | |
| CD4 | BD Biosciences | 740007 | |
| CD8 | BD Biosciences | 563786 | |
| CD69 | eBioscience | 25-0699-42 | |
| 抑制剂 | |||
| TG003 | Cayman Chemical | 来自激酶筛选文库 | |
| TG003 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| PKC 412 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| Doramapimod | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| 紫杉醇 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| 厄洛替尼 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| Necrostatin-5 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| NVP-BEZ235 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| 酞嗪酮吡唑 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| AG-879 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| 1-NA-PP1 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| Torin 1 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| 双吲哚马来酰亚胺 II | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| BIBF 1120 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| SMI-4a | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| 双吲哚马来酰亚胺 XI（盐酸盐） | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| CAY10657 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| AS-703026 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| 氯化小檗碱 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| 衣霉素 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| GSK 1059615 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| 鲁索利替尼 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| Necrostatin-1 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| SB 505124 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| INK128 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| 卡奈替尼（盐酸盐） | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| SB 431542 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| PD 173074 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| 丙戊酸（钠盐） | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| PD 0325901 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| SB 203580 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| VX-702 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| 大黄素 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| CHIR99021 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| BIO | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| 伊马替尼（甲磺酸盐） | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| 苹果酸舒尼替尼 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| 吉非替尼 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| PP2 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| 3-甲基腺嘌呤 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| Bisindolylmaleimide I | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| 双吲哚maleimide IV | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| 双吲哚马来酰胺 V | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| NSC 663284 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| D 4476 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| NU 7026 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| H-9（盐酸盐） | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| 吲哚紫红素-3'-单肟 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| KN-62 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| KN-93 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| CGP 57380 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| 异-鸟苷素 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| (S)-甘氨酰-H-1152（盐酸盐） | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| 双吲哚maleimide VIII（乙酸盐） | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| ST638 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| SU 6656 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| LY364947 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| SB 203580（盐酸盐） | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| CAY10621 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| YM-201636 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| ZM 447439 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| AS-041164 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| NVP-AEW541（盐酸盐） | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| PP242 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| ABT-869 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| CAY10622 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| 17β-hydroxy Wortmannin | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| CAY10626 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| SU 6668 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| CAY10572 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| N,N-二甲基鞘氨醇 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| LY294002 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| U-0126 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| Staurosporine | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| KN-92（盐酸盐） | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| AS-605240（钾盐） | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| O-1918 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| Y-27632（盐酸盐） | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| Leelamine | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| PD 98059 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| PD 169316 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| TGX-221 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| (S)-H-1152（盐酸盐） | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| AS-605240 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| D-erythro-十八碳鞘氨醇 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| OSU03012 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| JNJ-10198409 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| Leelamine（盐酸盐） | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| 花生四烯酸 利拉胺 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| 月桂酸利拉胺 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| AS-252424 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| CAY10505 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| PI-103 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| PIK-75（盐酸盐） | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| 鞘氨醇激酶抑制剂2 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| 白皮杉醇 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| SC-1 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| (R)-Roscovitine | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| BAY-43-9006 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| CAY10561 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| AS-604850 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| PI3-激酶 α 抑制剂2 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| ML-9 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| Triciribine | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| 厄布斯塔汀类似物 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| Kenpaullone | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| 雷帕霉素 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| AG-494 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| AG-825 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| AG-1478 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| SB 216763 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| SB 415286 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| AG-17 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| H-8（盐酸盐） | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| LFM-A13 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| SC-514 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| 芹菜素 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| AG-18 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| CAY10554 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| DRB | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| RG-13022 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| RG-14620 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| AG-490 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| AG-82 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| AG-99 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| AG-213 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| AG-183 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| Lavendustin C | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| ZM 336372 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| 5-碘代结核菌素 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| SB 202190 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| CAY10571 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| 尼洛替尼 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| SP 600125 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| L-threo-神经鞘氨醇 C-18 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| H-89 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| HA-1077（盐酸盐） | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| AG-370 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| 渥曼青霉素 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| AG-1296 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| KT 5823 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| Janex 1 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| CAY10574 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| CAY10575 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| CAY10576 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| NH125 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| TWS119 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| NSC 210902 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| CAY10577 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| CAY10578 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| PD 184161 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| CCT018159 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
| 杨梅素 | Cayman Chemical | - | 来自激酶筛选文库 |
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