小鼠骨髓来源巨噬细胞对抗体刺激的活化

摘要

来源：Kozicky, L. 等，基于抗体药物对小鼠骨髓和腹腔巨噬细胞活化作用的评估。J. Vis. Exp. (2017)

在本视频中，我们演示了骨髓来源巨噬细胞在细菌脂多糖和静脉注射免疫球蛋白刺激下的活化过程。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 骨髓巨噬细胞的衍生与抗体激活

1. 使用 CO₂ 窒息法实施安乐死。
   1. 将小鼠放入诱导室中，用 5% 异氟烷麻醉 60 - 90 秒，直至小鼠不动且呼吸深而缓慢。
   2. 关闭异氟烷麻醉，以 6 - 8 L/min 的流速通入 CO₂，直至小鼠停止呼吸。继续通入 CO₂ 至少 5 分钟。确认无心跳和呼吸后，实施颈椎脱位以确保死亡。
      注意：8 - 12 周龄的小鼠可获得最高产量的巨噬细胞。
2. 用 70% 乙醇喷洒小鼠腿部，并将其仰卧固定在泡沫板上，四肢伸展。用剪刀和镊子夹住皮肤，在每条后肢表面做浅切口（0.2 cm），去除皮肤和毛发。
   注意：本操作及所有组织培养操作均应在无菌操作台中进行。
3. 修剪肌肉以暴露胫骨和股骨。在髋关节下方和踝关节上方切断骨骼和肌肉，取出胫骨和股骨。尽可能去除附着的肌肉。
4. 用 70% 乙醇喷洒骨骼，静置 1 分钟使其挥发，然后将骨骼放入含骨冲洗培养基（Iscove 改良 Dulbecco 培养基（IMDM），10% 胎牛血清（FBS））的 6 孔板中。
5. 在踝端和股骨顶端各切除约 0.1 cm 骨质，暴露骨髓腔。确保可见骨髓，并能将 26 号针头插入骨髓腔。
6. 切断骨骼和肌肉，将胫骨和股骨与膝关节分离。将连接 10 mL 注射器的 26 号针头插入骨髓腔，用 5 mL 骨冲洗培养基将骨髓冲洗至 50 mL 锥形管中。每只小鼠的两根胫骨和两根股骨冲洗至同一 50 mL 管中。
7. 用移液器反复吹打数次，或以低速涡旋震荡，轻柔分散骨髓团块，使骨髓条状物分散成小于 0.5 mm 的小颗粒。用骨冲洗培养基补至 50 mL。将锥形管内容物转移至 75 cm² 组织培养处理过的培养瓶中，于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 1 小时。
   注意：成熟巨噬细胞和间充质细胞将贴壁并被弃去，而目标造血祖细胞则保持悬浮状态。
8. 将含造血祖细胞的培养基转移至 50 mL 锥形管中，在室温下以 300 x g 离心 5 分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于 5 mL 巨噬细胞集落刺激因子（MCSF）培养基（IMDM，10% FBS，5 ng/mL MCSF，100 U/mL 青霉素/链霉素，150 μM 单硫代甘油（MTG））中。
9. 使用血细胞计数板计数细胞。加入培养基将细胞重悬至浓度为 0.5 x 10⁶ 个细胞/mL，每瓶 30 mL 培养基中加入 1.5 x 10⁷ 个细胞，轻柔吹打混匀。将 30 mL 细胞悬液加入新的 75 cm² 组织培养处理过的培养瓶中。
10. 在初始培养后的第 4 天和第 7 天，使用倒置相差明场显微镜观察细胞是否贴壁并呈轻微分支状。弃去含非贴壁细胞的培养基，用 IMDM 洗涤细胞一次，加入 30 mL MCSF 培养基。
11. 当细胞在第 10 天成熟时（>95% F4/80 和 Mac-1 阳性），再次确认细胞贴壁并呈轻微分支状。
12. 为进行刺激实验铺板，从培养瓶中移除培养基，加入 8 mL 无酶、含 EDTA 的细胞解离缓冲液（材料表）。于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 5 分钟。
13. 使用无菌细胞刮棒施加轻微压力轻柔刮取细胞，显微镜下确认细胞已从瓶壁脱离。将解离的细胞转移至 50 mL 锥形管中。用 5 mL IMDM 洗涤培养瓶 3 次，合并洗涤液与收获的细胞。在室温下以 300 x g 离心 5 分钟。
14. 每 50 mL 锥形管中用 3 mL MCSF 培养基重悬细胞沉淀。使用血细胞计数板计数活细胞。将细胞重悬至浓度为 1 x 10⁶ 个细胞/mL，每孔加入 100 μL 细胞悬液（1 x 10⁵ 个细胞/孔），接种于 96 孔组织培养处理、平底板中。
    注意：一只小鼠的骨骼可获得足够接种 100 孔的细胞。如需要，也可将 1 mL 细胞悬液接种于 6 孔板（组织培养处理、平底）。若进行 Western 印迹分析，可使用更多细胞（1 x 10⁶ 个细胞）。
15. 待细胞贴壁后，对每组设置双复孔或三复孔，分别加入含 10 ng/mL LPS 的 IMDM、30 mg/mL IVIg，或 IVIg + LPS 进行刺激。LPS 或 IVIg 的剂量可进行滴定以优化反应。保留双复孔或三复孔作为未刺激对照组。于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 24 小时。
    注意：重新铺板的细胞应在 1 小时内贴附于组织培养孔中。
16. 将每孔的细胞上清液收集至单独的 1.7 mL 微量离心管中，以 10,000 x g 离心 5 分钟，去除颗粒物。
17. 小心移除细胞上清液，避免扰动沉淀。将澄清后的细胞上清液转移至无菌微量离心管中。
    注意：细胞上清液可立即或长期储存于 -80 °C，用于酶联免疫吸附测定（ELISA）检测细胞因子、IL-10 及细胞因子亚基 IL-12/23p40。请遵循商业试剂盒提供的 ELISA 操作流程（材料表）。其他促炎细胞因子（如 IL-6 和 TNF）也可检测，因为与单独使用 LPS 刺激相比，IVIg + LPS 共同处理可降低这些因子的表达。刺激后，贴壁细胞可用于 Western 印迹或定量聚合酶链式反应（Q-PCR）等实验技术。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Iscove 改良的 Dulbecco 培养基（IMDM）	Life technologies	12440053
胎牛血清（FBS）	Life technologies	12483-020
重组小鼠巨噬细胞集落刺激因子（MCSF）	Stemcell technologies	78059
青霉素-链霉素	Life technologies	15140148
细胞解离缓冲液	Life technologies	13150016	无酶，基于 Hanks 溶液，含 EDTA
脂多糖（LPS）	Sigma aldrich	L 4516	来源于大肠杆菌 E. coli 0127:B8
静脉注射免疫球蛋白（IVIg，Gammunex）	Grifols	由不列颠哥伦比亚儿童医院输血医学科提供
静脉注射免疫球蛋白（IVIg，Gammagard liquid）	Baxter Healthcare Corporation	由不列颠哥伦比亚儿童医院输血医学科提供
静脉注射免疫球蛋白（IVIg，Octagam）	Octapharma	由不列颠哥伦比亚儿童医院输血医学科提供
磷酸盐缓冲液（PBS，无菌），pH 7.4	Life technologies	10010023
小鼠 IL-10 ELISA 试剂盒	BD biosciences	555252
小鼠 IL-12/23p40 ELISA 试剂盒	BD biosciences	555165
15 mL 圆锥形离心管	BD biosciences	352096
50 mL 圆锥形离心管	BD biosciences	352070
微量离心管（1.7 mL）	Diamed	SPE155-N
75 cm2 组织培养处理过的培养瓶	BD biosciences	353136
细胞刮刀	BD biosciences	353085