来源：Kozicky, L.，等，基于抗体药物对小鼠骨髓及腹腔巨噬细胞活化作用的评估 J. Vis. Exp. (2017)
本视频展示了使用静脉注射免疫球蛋白和细菌脂多糖激活小鼠腹腔巨噬细胞的方法。共刺激可将腹腔巨噬细胞激活为具有免疫调节活性的抗炎型巨噬细胞。
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方法文章
小鼠模型中抗体诱导腹腔巨噬细胞的体内活化
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2025年7月8日
本文内容
摘要
方案
所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。
1. 小鼠的挑战实验 体内 静脉注射免疫球蛋白联合脂多糖（IVIg+LPS）处理及腹腔巨噬细胞的采集
- 称量每只小鼠。计算提供 2.5 g/kg 体重终剂量所需的 IVIg（100 mg/mL 储备浓度）体积。计算提供 0.2 μg/g 体重终剂量所需的 LPS（在 Iscove 改良 Dulbecco 培养基（IMDM）中 100 μg/mL 储备浓度）体积。
注意：例如，对于一只 20 g 的小鼠，需要 500 µL 的 IVIg 储备溶液和 40 μL 的 100 μg/mL LPS 溶液。 - 将所需量的 IVIg 和 LPS 抽入装有无菌 26 号针头的 1 mL 无菌注射器中。对于不接受 IVIg 的对照组小鼠，用等体积的无菌磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）替代 IVIg。
- 用一只手抓住小鼠颈背部皮肤，拇指和食指捏住皮肤，其余手指握住尾巴和后肢，使小鼠固定。将小鼠身体向地面倾斜。
- 将针头以相对于小鼠腹部 30–40° 的角度插入右下腹象限，针尖斜面朝上，插入深度为 1.5 cm。通过腹腔注射 IVIg + LPS 或 PBS + LPS。
- 1 小时后，使用二氧化碳（CO2）窒息法实施安乐死。
- 将小鼠放入诱导室中，以 5% 异氟烷麻醉 60–90 秒，直至小鼠不动且呼吸深慢。
- 关闭异氟烷麻醉，以 6–8 L/min 的流速通入 CO2 ，直至小鼠停止呼吸。继续通入 CO2 至少 5 分钟。确认无心跳和呼吸。进行颈椎脱位以确保死亡。
注意：8–12 周龄的小鼠可获得最高的巨噬细胞产量。
- 将小鼠四肢展开，固定在泡沫板上。用 70% 乙醇喷洒小鼠体表。
注意：操作应在无菌操作台中进行。 - 用剪刀沿小鼠中线在皮肤上做一个浅切口（0.2 cm），避免切开腹膜腔。用镊子将腹部皮肤从腹壁剥离，使完整的腹膜壁内层可见。
- 用 5 mL 无菌 PBS（pH 7.4）充满一支 5 mL 注射器。从左侧或右侧上方将 25 或 27 号针头插入腹腔顶部，针尖斜面朝上，朝向小鼠中心。
注意：小心插入针头，确保 PBS 注入腹腔空间，而非器官内。 - 将液体推入腹腔。拔出针头，按摩腹膜 10 秒以松动细胞。重新将针头插入腹腔顶部，避开器官，收集灌洗液并置于冰上的 15 mL 圆锥形离心管中。
注意：每注入 5 mL 液体，约可回收 3.75 mL。 - 重复注射和回收步骤（步骤 1.8–1.9）3 次（总注射体积为 20 mL），共回收 15 mL 灌洗液。将每只小鼠的灌洗液分别收集至不同的 15 mL 圆锥形离心管中。
注意：最后一次注射后，从小鼠左右两侧远端提取液体可能更容易，因为液体在此处积聚。该位置器官对针头的干扰较小。 - 在 4 °C 条件下，以 300 xg 离心 5 分钟沉淀细胞。取出 1 mL 回收的灌洗液，用于白细胞介素（如 IL-10 和 IL-12/23p40）的酶联免疫吸附测定（ELISA）分析，或按制造商说明操作，或将样本在 -80 °C 冻存以备后续分析。
注意：为确保灌洗液细胞因子分析在不同处理组间的准确比较，应对腹腔进行 4 次 5 mL 冲洗，最终总体积为 15 mL。每次冲洗均无法完全回收全部液体。 - 将每只小鼠冲洗所得的细胞重悬于 500 μL 铺板培养基（IMDM，含 10% 胎牛血清 FBS 和 100 U/mL 青霉素/链霉素）中。计数活巨噬细胞。
注意：巨噬细胞略大于其他腹腔细胞。使用野生型 C57BL/6 小鼠时，典型产量为每只小鼠 5 x 105 – 1 x 106 个巨噬细胞。
可选：若细胞沉淀中存在大量红细胞，可根据制造商说明进行裂解步骤以去除红细胞。 - 将细胞重悬于铺板培养基中，浓度为 1 x 106 个巨噬细胞/mL，并以每孔 100 μL 接种至 96 孔平底组织培养板中。
注意：实验中可能需要合并多只小鼠的细胞。例如，若一只小鼠获得 5 x 105 个巨噬细胞，则需要 500 μL 铺板培养基。 - 将细胞在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 1 小时，使巨噬细胞贴壁。贴壁细胞即为腹腔巨噬细胞。去除细胞上清液和非贴壁细胞。用 200 μL IMDM（预热至 37 °C）清洗孔板两次，每次静置 10 秒，缓慢倾斜孔板以去除液体。更换铺板培养基。在刺激前于 37 °C、5% CO2 条件下孵育 30 分钟。
- 贴壁后，分别用 10 ng/mL LPS（溶于 IMDM）、30 mg/mL IVIg 或 IVIg+LPS 刺激每组重复或三重复孔。LPS 或 IVIg 的剂量可进行滴定以优化反应。设置重复或三重复孔作为未刺激对照组。在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 24 小时。
注意：重新铺板的细胞应在 1 小时内贴附于组织培养孔。样本可立即使用，或冻存于 -80 °C 用于 ELISA 细胞因子分析。 - 将每孔的细胞上清液收集至单独的 1.7 mL 微量离心管中，并在 10,000 x g 条件下离心 5 分钟，以去除任何颗粒物质。
- 小心移除细胞上清液，避免扰动沉淀。将澄清后的细胞上清液转移至无菌微量离心管中。
注意：细胞上清液可立即通过 ELISA 检测细胞因子 IL-10 和细胞因子亚基 IL-12/23p40，或长期储存于 -80 °C。请遵循商业试剂盒（材料表）提供的 ELISA 操作流程。也可检测其他促炎细胞因子，如 IL-6 和肿瘤坏死因子（TNF），因为与单独使用 LPS 刺激相比，IVIg+LPS 共同处理可降低这些因子的表达。刺激后，贴壁细胞可用于 Western 印迹或定量聚合酶链式反应（Q-PCR）等技术分析。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Iscove 改良的 Dulbecco 培养基（IMDM） | Life technologies | 12440053 | |
| 胎牛血清（FBS） | Life technologies | 12483-020 | |
| 青霉素-链霉素 | Life technologies | 15140148 | |
| 1× 红细胞裂解缓冲液 | eBioscience | ||
| 细胞解离缓冲液 | Life technologies | 13150016 | 无酶，基于 Hanks 溶液，含 EDTA |
| 脂多糖（LPS） | Sigma aldrich | L 4516 | 来源于大肠杆菌 E. coli 0127:B8 |
| 静脉注射免疫球蛋白（IVIg，Gammunex） | Grifols | 由不列颠哥伦比亚儿童医院输血医学科提供 | |
| 静脉注射免疫球蛋白（IVIg，Gammagard liquid） | Baxter Healthcare Corporation | 由不列颠哥伦比亚儿童医院输血医学科提供 | |
| 静脉注射免疫球蛋白（IVIg，Octagam） | Octapharma | 由不列颠哥伦比亚儿童医院输血医学科提供 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS）（无菌），pH 7.4 | Life technologies | 10010023 | |
| 小鼠 IL-10 ELISA 试剂盒 | BD biosciences | 555252 | |
| 小鼠 IL-12/23p40 ELISA 试剂盒 | BD biosciences | 555165 | |
| 26 号针头 | BD biosciences | 305110 | |
| 1 mL 注射器 | BD biosciences | 309659 | |
| 10 mL 注射器 | BD biosciences | 309604 | |
| 15 mL 锥形管 | BD biosciences | 352096 | |
| 镊子 | VWR | 82027-386 | 细尖，解剖用 |
| 剪刀 | VWR | 82027-582 | 精细型，4 1/2" |
| 明场显微镜 | Motic | AE31 | 倒置相差显微镜 |
| 天平 | Mettler | PE 3000 |
