小鼠模型中疫苗诱导免疫对细菌感染的评估

摘要

来源：Caution, K.，等。小鼠宿主-病原体反应及疫苗效力的评估。J. Vis. Exp. (2019)。

在本视频中，我们介绍了一种用于检测无细胞百日咳疫苗在小鼠体内对百日咳鲍特菌（Bordetella pertussis）感染防护效果的实验方案。接种疫苗后，使小鼠感染病原体，并通过培养其组织匀浆样本，分析细菌菌落数量，以此作为评估疫苗诱导保护性免疫效果的指标。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 小鼠免疫

1. 在无菌生理缓冲液（如生理盐水或DPS）中配制疫苗主混悬液。
   注意： 混合液的总体积应比整个免疫组所需体积多出10%。疫苗组分的浓度详见步骤1.1.1和1.1.2。将物品置于冰上运送至动物房。
   1. 对于 B. pertussis 研究包括以下疫苗组：无细胞百日咳疫苗（aPV）和 aPV + 百日咳杆菌定植因子 A（BcfA）。此外，使用氢氧化铝佐剂、单独的疫苗抗原（丝状血凝素（FHA）和百日咳毒素相关蛋白（Prn））以及未免疫小鼠作为对照组。
      注意： aPV 是 1/5^th 一种经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的无细胞百日咳疫苗（aPV），其组分包括破伤风类毒素、减量白喉类毒素、百日咳毒素（PT）、丝状血凝素（FHA）和百日咳粘附素（Prn），吸附于铝盐。目前百日咳aPV的一个人用剂量为0.5 mL，因此1/5^th 剂量为0.1 mL。aPV + BcfA的体积为0.1 mL的aPV（1/5）^th 人体剂量）+ 每只小鼠0.046 mL BcfA（30 µg）。单块肌肉可安全注射的最大体积为0.1 mL。由于aPV + BcfA疫苗总体积超过0.1 mL，为确保安全接种，需将疫苗大致均等地注射至双侧肩部肌肉。
   2. 制备实验性疫苗时，每剂将1 µg FHA和0.5 µg Prn与50 µg氢氧化铝凝胶在无菌PBS中混合。将实验性aPV在室温（RT）下置于实验室滚轴混合器上混匀15分钟。随后，以18,000 x g 在 4 °C 下离心 5 分钟。弃去上清液，将沉淀物重悬于 1 mL 无菌 PBS 中。
2. 在动物实验室内，安装麻醉机（图1).
   注意： 使用前确保氧气和异氟烷各自储罐中的含量充足。称量异氟烷废气吸收罐的重量，当其重量增加50 g时予以更换。
3. 彻底清洁生物安全柜（BSC），并将洁净的诱导室放入BSC内。将麻醉机的麻醉气体输出管和废气清除管连接至诱导室。打开氧气瓶 通过 调节调节器以确保氧气流动，并将流量调至1.5–2 L/min。
4. 将所需年龄（6-12周）的小鼠放入诱导室中。开启异氟烷至2.5%-3%，以使小鼠轻度麻醉。持续观察动物，直至其在诱导室内停止活动且呼吸变慢。
5. 通过捏压脚趾测试诱导程度，观察是否有反射性运动。若无反射性反应，则小鼠已准备好进行注射。
   注意：在本实验中，可一次性对整个动物笼具进行麻醉。也可选择单独麻醉动物后再注射，或在不麻醉的情况下直接对动物进行注射。这几种方法均可行。
6. 同时，用1 mL胰岛素注射器（28G1/2）每支吸取0.1 mL疫苗备用。当动物完全麻醉后，从麻醉舱中取出一只动物，将小鼠腹侧朝下置于毛巾或实验台垫上。
7. 以45°角将注射器刺入小鼠三角肌，针尖斜面朝上，进针深度约5 mm，随后注射疫苗。
   注意： 可使用后肢/侧腹部作为注射部位，替代三角肌。
8. 注射后，将针头保留在肌肉内约5-10秒。注射完成后，将注射器旋转180°，使针尖斜面朝外，以形成密封并防止疫苗外漏。随后，缓慢将针头从注射部位拔出。
9. 将小鼠放回笼中。对指定组内的所有动物重复该操作。
10. 关闭异氟烷，用氧气冲洗诱导室，然后再麻醉下一笼小鼠。
11. 监测动物直至全部清醒并在笼内活动，然后将笼子放回饲养位置。
12. 接种后每12小时监测动物一次，持续至48小时，观察发病的临床症状，如毛发粗糙或蓬乱、步态迟缓或呼吸困难。若症状持续，应咨询机构兽医，并根据需要将小鼠剔除出研究。
13. 初次免疫4周后，通过麻醉小鼠并以此前使用的相同疫苗制剂对其右三角肌进行肌肉注射，以加强免疫。
14. 再次监测动物是否有任何临床症状。将动物继续饲养两周后，再进行感染操作。

2. 小鼠鼻内感染模型

1. 在动物房中，按照步骤 1.3 和 1.4 所述设置氧气和麻醉条件。如步骤 1.5 所述，将小鼠放入麻醉舱内进行麻醉。持续监测动物，直至麻醉生效。
2. 当小鼠进入麻醉状态后，逐只从诱导舱中取出。用手抓住小鼠背部肩胛骨后方的颈部皮肤，将其固定。将小鼠保持直立姿势，以便接触其鼻部。
3. 使用 200 µL 移液器吸头，缓慢将 40–50 µL 的 B. pertussis 菌液接种物滴加至小鼠鼻孔（每侧鼻孔 20–25 µL）。握住小鼠，直至全部接种物被吸入体内。若部分接种物以气泡形式溢出，应收集气泡并重新滴入鼻孔。对一组小鼠给予等量无菌 PBS 作为阴性对照。
4. 参照步骤 1.10–1.12 的操作，将接种后的小鼠放回笼中，并监测其状态，直至清醒并能够活动。将笼子放回架子上原来的饲养位置。在对下一组动物进行麻醉前，用氧气冲洗诱导舱，以清除残留的异氟烷。接种后持续监测小鼠 48 小时。
5. 在实验室中，将接种物用无菌 PBS 进行系列稀释后涂布平板，以确认实际递送至小鼠体内的菌落形成单位（CFUs）。取 0.1 mL 稀释液涂布于 10% BG + Sm 平板（添加了 10% 脱纤维羊血和 100 μg/mL 链霉素的 Bordet-Gengou 琼脂平板）上（图 2A）。将平板置于 37 °C 培养箱中培养 4 天。计数并计算递送至小鼠的接种物中的 CFUs（图 2B）。

3. 感染后动物组织的采集

1. 准备小鼠解剖和组织采集。
   1. 将处理组织所需的所有工具（粗剪刀、细剪刀、弯头剪刀、细镊子、研磨杵、三角刮刀）在高压灭菌器中进行灭菌。将工具密封于灭菌袋中。用铝箔包裹玻璃Dounce匀浆器，并贴上高压灭菌指示胶带以确认灭菌状态。
   2. 在组织采集前1至2天制备琼脂平板，确保使用前平板已完全凝固。对于B. pertussis，使用10% BG + Sm培养基。根据每个实验的经验确定所需稀释度，并为每只小鼠的肺组织平板做好标记。
   3. 准备并标记CFU稀释管。根据待处理器官数量及每个器官所需的稀释梯度，在无菌的1.5 mL微量离心管中加入0.9 mL无菌PBS。
   4. 准备并标记组织收集管：
      1. 肺组织：向无菌的15 mL锥形管中加入2 mL含1%酪蛋白的无菌PBS，置于4 °C保存。若需用于组织学分析，则向另一管中加入2 mL 10%中性缓冲福尔马林（NBF），室温保存。
   5. 新鲜配制70%乙醇，用于填充烧杯和喷雾瓶，以供解剖使用。
2. 在采集当天，将所有材料用推车运送至动物房。按照步骤1.3和1.4清洁生物安全柜并设置麻醉机。
3. 将待解剖的小鼠放入诱导室，通入氧气后开启异氟烷至5%，直至动物失去意识。逐只取出小鼠，并通过颈椎脱位作为辅助手段确保死亡。颈椎脱位后，应通过呼吸频率消失和/或撤足反射消失（脚趾夹捏测试）确认安乐死完成。
4. 将小鼠仰卧位固定于解剖板上，四肢展开并用针固定。用70%乙醇喷洒小鼠体表。
5. 使用镊子夹住腹部下方、骨盆中央的皮肤，用锋利剪刀沿中线垂直剪开至下颌。随后闭合剪刀，以小幅度动作将皮肤与腹膜壁分离。将皮肤向两侧翻开，为无菌器官采集提供无障碍操作视野。
6. 用镊子固定剑突处的肋骨 cage，剪开膈肌。肺组织应随之塌陷并向脊柱方向下垂。沿两侧剪开肋骨 cage，移除胸骨板。
7. 分离并取出右肺上叶，切断肺动脉和肺静脉。将该肺叶放入含有10% NBF的15 mL锥形管中，室温放置至少24小时以固定组织。随后分离右肺其余肺叶及左肺，将其放入含2 mL PBS中含1%酪蛋白的15 mL锥形管中，并立即置于冰上。
8. 将尸体放入生物危害袋中处理。在解剖下一只动物前，先用去离子水冲洗工具，然后将其浸入盛有70%乙醇的烧杯中。取出工具后甩去多余乙醇，继续进行下一例解剖。
9. 按照上述步骤依次完成每只小鼠的解剖。
10. 按以下所述方法处理组织。

4. 肺组织的处理

1. 将肺组织（置于2 mL含1%酪蛋白的PBS溶液中）转移至无菌的15 mL Dounce匀浆器中。使用研杵充分匀浆组织，直至无明显大块组织残留。将匀浆后的悬液重新转移回原15 mL离心管中。
2. 取0.3 mL匀浆液用于菌落形成单位（CFU）涂板，其余匀浆液于4 °C条件下以450 ×g离心5分钟。收集上清液，并以每管0.5 mL分装至预先标记的微量离心管中。将样品储存于-20 °C，待后续通过ELISA检测细胞因子。
3. 将0.1 mL肺组织匀浆悬液依次加入稀释管（含0.9 mL无菌PBS）中进行系列稀释。取经经验确定的合适稀释度的0.1 mL悬液，接种至预先标记的10% BG + Sm平板上，并使用无菌三角涂布棒均匀涂布。
4. 将平板置于室温空气中，于37 °C培养4天。
5. 计数并计算每肺组织的菌落形成单位（CFU）（图3）。简而言之，将所获得的CFU数值乘以平板对应的稀释倍数，再乘以器官处理时的总体积。随后将各动物的CFU数值转换为Log₁₀值并作图。
   1. 含有30–300个菌落的平板易于准确计数。菌落数少于6个的平板不应用于计算，因菌落数过低会引入较大误差。为确定检测下限，将器官匀浆的总体积除以从未稀释匀浆液中接种至平板的体积（例如，2 mL总体积除以0.1 mL未稀释匀浆液体积，得到可检测的最低限值为20 CFU）。

结果

图1：麻醉机装置示意图。 图示为一台麻醉蒸发器，连接有诱导室和废气清除系统（置于生物安全柜内）。

图2：鼻内接种剂量的计算。 (A)

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2L 诱导室	Vet Equip	941444
异氟烷	Vet One	V1 501017	任何品牌均可
酪蛋白	Sigma	C-7078
鲍-金琼脂基础培养基	BD bioscience	248200
器械——剪刀、弯头剪、镊子、精细镊子、三角形撑开器			任何品牌均可
15 mL 玻璃匀浆器	Wheaton	357544	任何类似品牌均可
无线手持匀浆器	Kontes/Sigma	Z359971-1EA	任何类似品牌均可
3 mL 注射器	BD bioscience	309657
15 mL 锥形离心管	Fisher	339651
1.5 mL 微量离心管	Denville	C2170
1 mL 胰岛素注射器 28G1/2	Fisher Scientific/Excel Int.	14-841-31