抗原包被微珠激活后B淋巴细胞中的细胞器动力学

摘要

来源：Ibañez-Vega, J.，等，研究B细胞在免疫突触形成过程中的细胞器动力学。J. Vis. Exp. (2019)

在本视频中，我们介绍了一种研究B淋巴细胞在经抗原包被的微珠激活后细胞器动态变化的方法。

方案

注意：以下步骤使用 IIA1.6 B 细胞进行。

1. 使用抗原包被的微珠激活B细胞

1. 抗原包被微球的制备
   1. 为了激活B细胞，使用NH₂-共价包被抗原的珠粒（Ag-包被珠粒），使用50 µL（约20 × 10⁶）制备⁶ 3 µm NH微珠₂-beads 负载激活性（BCR-配体+）或非激活性（BCR-配体-）抗原。
   2. 对于 IIA1.6 B 细胞，使用抗 IgG-F(ab')₂ 片段作为 BCR-配体+ 和抗 IgM-F(ab')₂ 或使用牛血清白蛋白（BSA）作为BCR配体。要激活原代B细胞或IgM+ B细胞系，请使用抗IgM-F(ab')₂ BCR-配体阳性（BCR-ligand+）和牛血清白蛋白（BSA）作为 BCR-配体阴性（BCR-ligand-）
      注意： 为避免配体与 Fc 受体结合，请使用 F(ab') 或 F(ab')₂ 抗体片段而非全长抗体
   3. 为制备银涂层微珠，将微珠置于低蛋白吸附的微量离心管中，以在样品操作过程中最大限度地回收微珠。加入1 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤微珠，并在16,000 × g条件下离心 g 5 分钟后，吸除上清液。
   4. 用500 µL 8%戊二醛重悬珠子以活化NH₂ 分组并在室温（RT）下旋转孵育4小时。
      警告： 戊二醛储备液仅可在化学通风橱中使用。请遵循材料安全数据表（MSDS）中的说明。
   5. 离心珠子，16,000 x g 孵育5分钟，去除戊二醛，再用1 mL 1×PBS洗涤珠子三次。
      警告： 戊二醛溶液应作为危险化学废物丢弃。
   6. 将活化的磁珠重悬于 100 µL 1x PBS 中。样品可分装至两个低蛋白结合的微量离心管中：50 µL 用于 BCR-ligand+，50 µL 用于 BCR-ligand-。
   7. 准备抗原溶液时，使用两个2 mL低蛋白结合微离心管，每管中含有150 µL PBS配制的100 µg/mL抗原溶液：一管加入BCR-ligand+，另一管加入BCR-ligand-。
   8. 向每管含有150 µL抗原溶液的试管中加入50 µL活化磁珠溶液，涡旋混匀，并在4 °C旋转孵育过夜。
   9. 加入500 µL浓度为10 mg/mL的BSA以封闭剩余的活性NH₂ 珠子上的基团在4 °C下旋转孵育1小时。
   10. 以 16,000 x g 离心珠子 g 4 °C下离心5分钟，弃上清液。用预冷的1×PBS再洗涤磁珠3次。
   11. 将活化的磁珠重悬于70 µL的1x PBS中。
   12. 为确定银涂层微珠的最终浓度，取少量微珠用PBS稀释（1:200），使用血细胞计数板进行计数，随后于4 °C保存备用。
       注意： 银涂层珠不应储存超过1个月。

2. 多聚-L-赖氨酸盖玻片的制备

1. 在使用抗原包被的微珠进行B细胞活化实验之前，先准备多聚-L-赖氨酸包被的盖玻片（PLL-盖玻片）。取一个50 mL离心管，加入40 mL浓度为0.01%（w/v）的PLL溶液，将直径为12 mm的盖玻片浸入溶液中，室温下旋转孵育过夜。
2. 用1×PBS洗涤盖玻片，然后置于包有石蜡膜的24孔板盖上晾干。随后进行B细胞活化实验。

3. B细胞活化

1. 使用磁珠启动B细胞活化时，首先将IIA1.6 B细胞系用CLICK培养基（RPMI-1640，添加2 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺 + 55 µM β-巯基乙醇 + 1 mM 丙酮酸钠 + 100 U/mL 青霉素 + 100 µg/mL 链霉素）加5%热灭活胎牛血清[FBS]）稀释至1.5 × 10⁶ 个细胞/mL。
2. 取100 µL（150,000个细胞）IIA1.6 B细胞与抗原包被的磁珠按1:1比例混合于0.6 mL离心管中。使用涡旋振荡器轻轻混匀，然后接种到PLL包被的盖玻片上。将样本置于细胞培养箱中（37 °C / 5% CO₂）孵育不同时间点。典型的活化时间点为0、30、60和120分钟。对于0分钟时间点，将PLL盖玻片置于24孔板盖内并置于冰上，加入细胞与抗原包被磁珠的混合液，在冰上孵育5分钟。
   注意：应使用涡旋振荡器混匀，避免反复吹打，因为后者可能导致磁珠在移液器塑料吸头中聚集，从而减少样本中的磁珠数量。每次实验均应使用包被BCR配体阴性对照的磁珠作为阴性对照。建议先开始最长孵育时间的样本活化，再依次进行较短时间点的处理。合理安排各样本的活化时间间隔，以便所有样本能同时进入固定步骤。
3. 向每张盖玻片加入100 µL预冷的1× PBS，以终止活化反应，随后继续进行免疫荧光染色实验流程。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
IIA1.6（A20 变体）小鼠 B 淋巴瘤细胞	ATCC	TIB-208	来源于 Balb/c 小鼠的鼠源性 B 细胞淋巴瘤，其表面表达含 IgG 的 BCR，但不表达 FcγIIR
100% 甲醇	Fisher Scientific	A412-4
直径 10 mm、厚度 1 号圆形盖玻片	Marienfield-Superior	111500
Amino-Dynabeads	ThermoFisher	14307D
抗中心粒周围蛋白抗体（Anti-pericentrin）	Abcam	ab4448	推荐稀释比例为 1:200，但应进行优化
抗 rab6 抗体（Anti-rab6）	Abcam	ab95954	推荐稀释比例为 1:200，但应进行优化
抗 sec61 抗体（Anti-sec61）	Abcam	ab15575	推荐稀释比例为 1:200，但应进行优化
BSA	Winkler	BM-0150
3.00 μm 聚苯乙烯氨基微球（Polybead Amino Microspheres）	Polyscience	17145-5
聚-L-赖氨酸（Poly-L-Lysine）	Sigma	P8920	用无菌水稀释
RPMI-1640 培养基	Biological Industries	01-104-1A
吐温 X-100（Triton X-100）	Merck	9036-19-5
50 ml 离心管	Corning	353043