抗原包被盖玻片上的B细胞活化

摘要

来源：Ibañez-Vega, J.，等，研究B细胞在免疫突触形成过程中的细胞器动力学。J. Vis. Exp. (2019)

本视频展示了B细胞的活化过程 体外该过程涉及抗原与B细胞受体的相互作用，进而引发细胞骨架重塑、免疫突触形成、溶酶体移动、抗原内化、加工处理，并最终将抗原呈递于MHC分子上，以激活B细胞。

方案

1. 多聚-L-赖氨酸盖玻片的制备

1. 在使用抗原包被的磁珠进行B细胞活化实验之前，先准备聚-L-赖氨酸包被的盖玻片（PLL-盖玻片）。取一个50 mL离心管，加入40 mL 0.01% w/v的PLL溶液，将直径为12 mm的盖玻片浸入溶液中，室温下旋转孵育过夜。
2. 用1×PBS洗涤盖玻片，并将其放置于覆盖有石蜡膜的24孔板盖上晾干。随后进行B细胞活化实验。

2. 抗原包被盖玻片上的B细胞活化

1. 抗原包被盖玻片的制备
   1. 激活前，配制抗原溶液（含10 µg/mL BCR配体+和0.5 µg/mL 大鼠抗小鼠CD45R/B220的1×PBS溶液）。
   2. 注意：建议在实验前一天制备盖玻片。B220可增强B细胞的黏附，但BCR-Ligand+已足以诱导细胞铺展反应。
   3. 将12 mm盖玻片置于涂有石蜡膜的24孔板盖上，每张盖玻片上加入40 µL抗原溶液，4 °C过夜孵育。密封孔板以防止抗原溶液蒸发。
   4. 用1×PBS洗涤盖玻片并自然晾干。
2. B细胞激活
   1. 开始激活时，将IIA1.6 B细胞用CLICK培养基（含5% FBS）稀释至1.5 × 10⁶ 个细胞/mL。
   2. 向抗原包被的盖玻片（Ag-盖玻片）上加入100 µL细胞悬液，在37 °C、5% CO₂的细胞培养箱中孵育不同时间点进行激活。通常的激活时间点为0、30和60分钟。
      注意：与第1部分相同，建议从最长的激活时间点开始，以便所有样品可同时进行固定。
   3. 对于0时间点，将含有Ag-盖玻片的24孔板盖置于冰上，加入细胞，在冰上孵育5分钟。
   4. 小心吸除每张Ag-盖玻片上的培养基，然后加入100 µL冷的1×PBS以终止激活反应。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
IIA1.6（A20 变异株）小鼠 B 淋巴瘤细胞	ATCC	TIB-208	源自Balb/c小鼠的B细胞淋巴瘤，其表面表达含IgG的BCR，但不表达FcγIIR
CaCl2	温克勒	CA-0520
甘氨酸	温克勒	BM-0820
HyClone 胎牛血清	赛默飞世尔科技	SH30071.03	56 °C 加热灭活 30 分钟
KCl	温克勒	PO-1260
NaCl	温克勒	SO-1455
Parafilm	M	P1150-2
青霉素-链霉素	赛默飞世尔科技	15140122	液体
聚-L-赖氨酸	Sigma	P8920	用无菌水稀释
RPMI-1640	生物工业公司	01-104-1A
丙酮酸钠	赛默飞世尔科技	11360070
50 ml 离心管	康宁	353043
2-巯基乙醇	赛默飞世尔科技	21985023
谷氨酰胺	赛默飞世尔科技	35050061
山羊抗小鼠IgG抗体	Jackson ImmunoResearch	315-005-003	IIA1.6 阳性配体