抗C-fms抗体对小鼠骨髓细胞体外破骨细胞生成的影响

摘要

来源：Marahleh, A.，等。抗c-fms抗体对体外破骨细胞前体形成及增殖的影响。J. Vis. Exp. (2019)

在本视频中，我们展示了不同抗 c-fms 抗体浓度对破骨细胞生成的影响，破骨细胞生成是指破骨细胞前体形成破骨细胞的过程。

方案

1. 骨髓来源巨噬细胞（BMM）的制备

1. 在10 cm培养皿中接种1 × 10⁷ 个细胞/10 mL，并加入M-CSF至终浓度为100 ng/mL。将细胞在37 °C、5% CO₂条件下培养3天。
2. 培养3天后，移除培养基，用10 mL磷酸盐缓冲液（PBS）剧烈冲洗细胞两次，以去除未贴壁细胞；加入5 mL室温的含0.02%胰蛋白酶-EDTA的PBS溶液，在37 °C、5% CO₂条件下孵育5分钟。
3. 通过充分吹打使细胞脱落。在显微镜下观察确认细胞是否已脱落（细胞应呈圆形并悬浮于培养基中）。若细胞仍贴壁，需重复充分吹打直至脱落。细胞脱落后，加入5 mL α-MEM以终止反应。
4. 将细胞收集至50 mL锥形离心管中，在300 × g条件下离心5分钟。弃上清，用5 mL α-MEM洗涤细胞沉淀。
5. 在300 × g条件下离心5分钟，将沉淀重悬于10 mL α-MEM中。
6. 进行细胞计数。
7. 在10 cm培养皿中接种1 × 10⁶ 个细胞/10 mL，并加入M-CSF至终浓度为100 ng/mL。将细胞在37 °C、5% CO₂条件下培养3天。

2. 以骨髓来源巨噬细胞作为破骨细胞前体生成破骨细胞

1. 培养3天后，收集贴壁细胞，这些细胞代表作为破骨细胞前体的骨髓来源巨噬细胞（BMM），操作步骤参照1.2–1.7。
2. 将BMM以每孔200 μL α-MEM培养基中接种5 × 10⁴ 个细胞的密度接种于96孔板中。加入RANKL，使其终浓度为50 ng/mL，或加入TNF-α，使其终浓度为100 ng/mL。向每孔中加入M-CSF，使其终浓度为100 ng/mL。
3. 向每孔中加入抗c-fms抗体，终浓度分别为0、1、10、100、1000 ng/mL。
4. 在37 °C、5% CO₂条件下培养4天。每隔一天更换一次培养基，共更换两次。

3. 抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色

1. 孵育 4 天后，轻轻吸去每个孔中的培养基，每孔用 200 μL 室温 1x PBS 洗涤一次。
2. 每孔加入 200 μL 10% 甲醛溶液进行固定，在室温下孵育 1 小时。吸去甲醛溶液，每孔用去离子水洗涤 3 次。
3. 每孔加入 200 μL 含 0.2% Triton X-100 的 PBS 溶液进行通透处理，在室温下孵育 1 小时。吸去 Triton X-100 溶液，每孔用去离子水洗涤 3 次。
4. 每孔加入 200 μL TRAP 染色液，显微镜下观察染色情况。染色完全显色需要 10–30 分钟。
5. 吸去染色液，每孔用去离子水洗涤 3 次，自然晾干。置于室温保存，用于后续观察。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗c-Fms抗体			AFS98，一种大鼠单克隆抗小鼠c-Fms抗体（IgG2a）
RANKL	PEPROTECH	315-11	重组小鼠可溶性RANK配体，来源：大肠杆菌（E.coli）
M-CSF			重组人M-CSF。取CMG14–12细胞系在10 cm悬浮培养皿中以5×10⁶个细胞培养所得上清液的1/10体积。
α-MEM	Wako		含L-谷氨酰胺和酚红
胎牛血清	Biowest	s1820-500	源自法国的胎牛血清
培养皿	Corning		100 mm × 20 mm 规格培养皿
96孔板	Thermofisher Scientific		Nunclon Delta表面处理