成年果蝇胸腔内病毒纳米注射以研究宿主-病毒相互作用

摘要

来源：Yang, S., 等. 建立病毒感染及宿主-病毒相互作用分析 黑腹果蝇. 视频实验杂志 (2019).

在本视频中，我们介绍了一种将正义单链RNA病毒纳米注射至成年雄性Drosophila果蝇体内的方法，并随后研究由此感染引发的抗病毒免疫反应。通过聚合酶链式反应分析，可鉴定出感染果蝇中特定基因的上调表达，表明RNA干扰和JAK/STAT信号通路等免疫反应通路被激活。

方案

1. 病毒感染在 黑腹果蝇

1. 通过纳米注射感染果蝇并进行生存率检测。
   1. 拉制毛细管以制备注射针，用油从后端填充注射针，并组装注射仪。
   2. 在通入少量二氧化碳的麻醉垫上麻醉果蝇₂通过胸腔内注射将50.6 nL病毒溶液（100 PFU，用Tris-HCl缓冲液pH 7.2稀释）接种果蝇。每瓶接种至少20只果蝇，至少接种3瓶。
      注意： 注射过程耗时较长（通常每小时可处理约100只果蝇）且 果蝇 C病毒（DCV）的复制速度非常快，因此在完成每管（20只果蝇）操作后，立即在管上记录准确时间至关重要。仅注射缓冲液的组设为模拟对照（mock control）。通常优先选用雄性成年果蝇，因为与雌性相比，其实验结果更稳定、可重复性更高，而雌性在交配和繁殖过程中的激素波动可能影响实验读数。
   3. 将注射后的果蝇置于25 °C、60%湿度及正常明暗循环条件下培养。每天提供新鲜食物，并记录死亡果蝇数量。
   4. 至少进行3次生物学重复实验，并绘制生存曲线。
   5. 使用统计软件对生存数据进行统计分析，绘制Kaplan-Meier生存曲线。通过log-rank检验计算P值。在生存表中输入每位受试者的信息，软件将据此计算各时间点的生存率，并绘制Kaplan-Meier生存曲线。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
显微镜	Olympus	CKX41
Nanoject II 自动纳升级注射器	Drummond Scientific	3-000-204	Nanoject II 可变体积（2.3 至 69 nL）自动注射器，配备玻璃毛细管（110V）
Schneider's 昆虫培养基	Sigma	S9895	细胞培养
10 cm 细胞培养皿	Sigma	CLS430167	细胞培养
Drosophila 培养箱	Percival	I-41NL	果蝇饲养
0.22 µm 滤膜	Millipore	SLGP033RS
1.5 ml 微量离心管	Brand	352070
1.5 ml 无RNase微量离心管	Axygen	MCT-150-C
ABI 7500 qPCR 系统	ABI	7500	qPCR
离心机	Eppendorf	5810R
离心机	Eppendorf	5424R
氯仿	Sigma	151858	RNA 提取
DEPC 处理水	Sigma	95284-100ML	RNA 提取
异丙醇	Sigma	I9516	RNA 提取
裂解缓冲液（RNA 提取）	Thermo Fisher	15596026	TRIzol 试剂
裂解缓冲液（液体样本RNA提取）	Thermo Fisher	10296028	TRIzol LS 试剂
光学粘合膜	ABI	4360954	qPCR
青霉素-链霉素溶液	Invitrogen	15140-122	细胞培养
qPCR 板	ABI	A32811	qPCR
统计分析软件	GraphPad Prism 7
TransScript Fly 第一链 cDNA 合成超混合液	TransScript	AT301	RNA 提取
涡旋振荡器	IKA	VORTEX 3	RNA 提取
胎牛血清（FBS）	Invitrogen	12657-029	细胞培养
平底96孔板	Sigma	CLS3922	细胞培养
细胞培养箱	Sanyo	MIR-553
100 根替换用毛细管	Drummond Scientific	3-000-203-G/X