成年果蝇胸腔内病毒纳米注射以研究宿主-病毒相互作用

摘要

来源：Yang, S., 等. 建立病毒感染及宿主-病毒相互作用分析 黑腹果蝇. 视频实验杂志 (2019).

在本视频中，我们介绍了一种将正义单链RNA病毒纳米注射至成年雄性Drosophila果蝇体内的方法，并随后研究由此感染引发的抗病毒免疫反应。通过聚合酶链式反应分析，可鉴定出感染果蝇中特定基因的上调表达，表明RNA干扰和JAK/STAT信号通路等免疫反应通路被激活。

方案

1. 病毒感染在 黑腹果蝇

1. 通过纳米注射感染果蝇并进行生存率检测。
   1. 拉制毛细管以制备注射针，用油从后端填充注射针，并组装注射仪。
   2. 在通入少量二氧化碳的麻醉垫上麻醉果蝇₂通过胸腔内注射将50.6 nL病毒溶液（100 PFU，用Tris-HCl缓冲液pH 7.2稀释）接种果蝇。每瓶接种至少20只果蝇，至少接种3瓶。
      注意： 注射过程耗时较长（通常每小时可处理约100只果蝇）且 果蝇 C病毒（DCV）的复制速度非常快，因此在完成每管（20只果蝇）操作后，立即在管上记录准确时间至关重要。仅注射缓冲液的组设为模拟对照（mock control）。通常优先选用雄性成年果蝇，因为与雌性相比，其实验结果更稳定、可重复性更高，而雌性在交配和繁殖过程中的激素波动可能影响实验读数。
   3. 将注射后的果蝇置于25 °C、60%湿度及正常明暗循环条件下培养。每天提供新鲜食物，并记录死亡果蝇数量。
   4. 至少进行3次生物学重复实验，并绘制生存曲线。
   5. 使用统计软件对生存数据进行统计分析，绘制Kaplan-Meier生存曲线。通过log-rank检验计算P值。在生存表中输入每位受试者的信息，软件将据此计算各时间点的生存率，并绘制Kaplan-Meier生存曲线。
      注意： 切勿向小瓶中添加额外的酵母。与模拟对照组相比，DCV感染的果蝇偶尔会出现腹水且行动笨拙，这使其容易粘附酵母。在预实验中最好记录更多时间点，以确定感染果蝇发生大规模死亡的时间范围。通常情况下，即使对于感染果蝇，其在前两天内也很少死亡。 Dicer-2 突变体品系。对于 Wolbachiaw1118（Bloomington 5905）果蝇感染100 PFU的DCV后，死亡时间窗口约为感染后3至5天。注射后0.5小时内死亡的果蝇不应计入死亡率，因其死亡可能由针刺损伤所致，而非病毒感染引起。

2. 通过细胞病变效应（CPE）检测法测定DCV载量

1. 第1天，按照步骤1.1.1–1.1.2所述方法感染雄性果蝇。将注射后的果蝇每20只分为一组，置于新鲜果蝇培养基中培养至所需时间（通常为24小时或3天）。每天为果蝇更换新鲜食物。
2. 第2天，在10 cm细胞培养皿中接种黑腹果蝇S2*细胞，细胞密度约为5 × 10⁶ 至 1 × 10⁷ 个细胞/mL。
3. 第3天，在轻微CO₂气流下收集5只果蝇，将其置于1.5 mL离心管中，加入200 μL Tris缓冲液和陶瓷珠，使用匀浆器研磨30秒。样品可储存于-80 °C，或立即进行下一步操作。
4. 充分涡旋振荡样品。使用1 mL注射器和0.22 μm滤器将上清液过滤至新的1.5 mL离心管中。
5. 用S2*细胞完全培养基对上清液进行10倍系列稀释。每孔加入50 μL稀释液。将未加病毒的50 μL培养基加入设为阴性对照孔的孔中。
   注意：每个稀释度使用8个孔。由于典型DCV产量约为10⁸–10⁹ PFU/mL，稀释范围应至少覆盖~10^-5–10^-10。
6. 第4天，使用20X或40X物镜的明场显微镜观察细胞病变效应（CPE）。若孔中细胞形态模糊、培养基中充满碎片，则判为“阳性孔”；若细胞形态正常，则判为“阴性孔”。
7. 分别用“+”或“–”标记出现细胞病变效应（CPE）的阳性孔或阴性孔，并计算平均组织培养感染剂量（TCID₅₀）。

3. 通过qRT-PCR检测DCV载量

1. 第1天，按上述方法感染果蝇。将注射后的雄性果蝇分组（每组20只），置于新鲜的果蝇培养基上培养所需时间，通常为24小时或3天。每天为果蝇更换新鲜食物。
2. 第3天，在轻度CO₂气流下收集5只果蝇，放入含200 μL裂解缓冲液和20颗陶瓷珠（直径 = 0.5 mm）的1.5 mL离心管中，使用匀浆器高速研磨30秒。每管再加入800 μL裂解缓冲液，将样品于-80 °C保存，或立即进行RNA提取和qRT-PCR。
3. 准备无RNase的枪头、离心管，以及去离子、焦碳酸二乙酯（DEPC）处理并经0.22 μm滤膜过滤的水。向样品中加入200 μL氯仿（≥99.5%），手动剧烈振荡15秒。室温孵育5分钟或更长时间，直至水相与有机相明显分离。
   注意：氯仿具有极高危险性，操作时必须小心。切勿使用涡旋振荡器，以免增加DNA污染风险。
4. 在4 °C条件下，以13,000 x g离心15分钟。
5. 吸取400 μL上清液转移至新离心管中。加入等体积的异丙醇（≥99.5%），手动轻轻颠倒混匀20次，室温沉淀10分钟或更长时间。
   注意：在-20 °C沉淀可提高RNA得率。
6. 在4 °C条件下，以13,000 x g离心10分钟。管底可见白色RNA沉淀。
7. 弃去上清液，加入1 mL 70%乙醇（乙醇溶于DEPC水），轻轻颠倒数次以洗涤RNA。
8. 在4 °C条件下，以13,000 x g离心5分钟。弃去上清液，将RNA干燥5–10分钟；RNA应变为透明状。
9. 向样品中加入50 μL DEPC水，用移液器吹打数次，然后涡旋振荡。
10. 取3 μL RNA用于测定RNA浓度。在260 nm处测定吸光值。通常，本方案提取的RNA浓度约为100–500 μg/μL，适用于cDNA合成。
11. 取2 μg RNA用于cDNA合成。用ddH₂O将样品稀释至100 μL，于-20 °C保存。
12. 按照试剂盒说明书进行qRT-PCR并运行反应。
    注意：对于DCV的cDNA合成，随机引物的效果明显优于Poly A引物。DCV mRNA的表达水平以内源性核糖体蛋白49（rp49）mRNA为参照进行标准化。本部分所用寡核苷酸引物如下：
    rp49 5' AGATCGTGAAGAAGCGCACCAAG 3'（正向）和
    5' CACCAGGAACTTCTTGAATCCGG 3'（反向）；
    DCV，5' TCATCGGTATGCACATTGCT 3'（正向）和
    5' CGCATAACCATGCTCTTCTG 3'（反向）；
    vago，5' TGCAACTCTGGGAGGATAGC 3'（正向）和
    5' AATTGCCCTGCGTCAGTTT 3'（反向）；
    病毒诱导RNA 1（vir-1）5' GATCCCAATTTTCCCATCAA 3'（正向）和
    5' GATTACAGCTGGGTGCACAA 3'（反向）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
显微镜	Olympus	CKX41
Nanoject II 自动纳升级注射器	Drummond Scientific	3-000-204	Nanoject II 可变体积（2.3 至 69 nL）自动注射器，配备玻璃毛细管（110V）
Schneider's 昆虫培养基	Sigma	S9895	细胞培养
10 cm 细胞培养皿	Sigma	CLS430167	细胞培养
Drosophila 培养箱	Percival	I-41NL	果蝇饲养
0.22 µm 滤膜	Millipore	SLGP033RS
1.5 ml 微量离心管	Brand	352070
1.5 ml 无RNase微量离心管	Axygen	MCT-150-C
ABI 7500 qPCR 系统	ABI	7500	qPCR
离心机	Eppendorf	5810R
离心机	Eppendorf	5424R
氯仿	Sigma	151858	RNA 提取
DEPC 处理水	Sigma	95284-100ML	RNA 提取
异丙醇	Sigma	I9516	RNA 提取
裂解缓冲液（RNA 提取）	Thermo Fisher	15596026	TRIzol 试剂
裂解缓冲液（液体样本RNA提取）	Thermo Fisher	10296028	TRIzol LS 试剂
光学粘合膜	ABI	4360954	qPCR
青霉素-链霉素溶液	Invitrogen	15140-122	细胞培养
qPCR 板	ABI	A32811	qPCR
统计分析软件	GraphPad Prism 7
TransScript Fly 第一链 cDNA 合成超混合液	TransScript	AT301	RNA 提取
涡旋振荡器	IKA	VORTEX 3	RNA 提取
胎牛血清（FBS）	Invitrogen	12657-029	细胞培养
平底96孔板	Sigma	CLS3922	细胞培养
细胞培养箱	Sanyo	MIR-553
100 根替换用毛细管	Drummond Scientific	3-000-203-G/X