苏木精和伊红染色法评估DSS诱导结肠炎中的结肠损伤

摘要

来源：Du, Y., 等 味觉信号蛋白缺失对炎症性肠病小鼠模型肠道炎症的影响。J. Vis. Exp. (2018)

本视频演示了苏木精和伊红（H&E）染色法，用于评估DSS诱导结肠炎小鼠模型中结肠损伤的情况——这是一种炎症性肠病。在从小鼠体内分离出DSS处理后的结肠组织并获取组织切片后，通过H&E染色可帮助识别由炎症介导的组织损伤。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 小鼠和DSS的准备

1. 将基因敲除小鼠（α-gustducin^-/-）与年龄、性别和体重相匹配的野生型对照小鼠（α-gustducin^+/+）C57BL/6 小鼠分别饲养于清洁的笼具中。
   注意：基因敲除小鼠已与 C57BL/6 小鼠回交超过 20 代，具有接近 100% 的 C57BL/6 遗传背景。
2. 将 30 g 右旋糖酐硫酸钠（DSS）粉末溶于 1 L 高压灭菌水中，搅拌至溶液澄清，确保终工作浓度为 3%（w/v）。
   注意：DSS 溶液可在室温下保存最多 1 周，或置于 4 °C 保存至使用。

2. 小鼠DSS结肠炎的诱导与评估

1. 称重并记录每只小鼠的初始体重。将小鼠分别放入标准塑料笼中，并标记笼子。
2. 将普通饮用水替换为3% DSS溶液，连续供应7天，两组小鼠均可自由摄取 ad libitum。
3. 在DSS处理期间，每天测量小鼠体重，记录DSS溶液消耗量，并收集和检查每只小鼠的粪便。观察腹泻和直肠出血的严重程度，并将其转换为DSS诱导的疾病指数。
4. 实验过程中，通过计算相对于初始体重的体重下降百分比和疾病指数来评估结肠炎症状。
   注意：疾病指数结合腹泻和直肠出血的观察结果进行评分，定义如下：0分（粪便正常，无血）、1分（粪便偏软，无血）、2分（粪便偏软，少量血）、3分（粪便很软，中度出血）、4分（水样便，明显出血）。每只小鼠的疾病指数每日进行分析。
5. 在7天DSS处理结束后，通过颈椎脱位法处死小鼠，并继续进行后续实验。

3. 组织样本的制备

1. 将小鼠置于仰卧位，用70%乙醇清洁腹部皮肤。用一把小剪刀在腹部做一条3 cm长的正中切口，以暴露腹腔。
2. 使用镊子小心地将脾脏与其他组织分离，然后取出脾脏并测量其大小。
3. 用镊子识别并提起结肠，将其从周围肠系膜中分离。将整个结肠拉出，直至盲肠和直肠可见。
4. 在结肠-盲肠交界处和盆腔深部横断结肠，分别游离近端和远端结肠，从而分离结肠。然后测量并记录分离后结肠的长度。在解剖过程中注意不要损伤结肠组织。
5. 使用配备灌胃针头的10 mL注射器，以10 mL冰冻磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗结肠，清除粪便和血液，直至流出液完全澄清。
6. 为进行组织学鉴定，将组织样本均分为三部分：近端、中段和远端。然后在4 °C条件下用4%多聚甲醛（PFA）固定组织过夜。

4. DSS诱导结肠炎严重程度的组织学评估

1. 苏木精-伊红（H&E）染色
   1. 固定后，将组织置于含有30%蔗糖的1× PBS溶液中，在15 mL离心管中4°C过夜浸泡，以对样本进行冷冻保护。
   2. 将组织包埋于最佳切割温度（OCT）包埋剂中，并置于-20 °C直至OCT完全凝固。
   3. 将含有组织的OCT包埋块转移至冷冻切片机中，将切片厚度调节至12 µm，切取并收集厚度为12 µm的冷冻切片。
   4. 将冷冻切片机切取的组织切片置于65 °C加热板上加热20分钟。
   5. 用蒸馏水短暂漂洗切片，随后加入苏木精染色液染色5分钟，再用流动自来水冲洗5分钟。
   6. 用0.5%盐酸-乙醇溶液分化30秒，流动自来水冲洗1分钟；然后用1× PBS漂洗1分钟，再用流动自来水冲洗5分钟。
   7. 依次用70%、75%、80%和95%乙醇溶液各漂洗10秒；随后用伊红染色液复染2分钟。
   8. 用95%乙醇脱水，再用无水乙醇更换两次，每次5分钟；最后用二甲苯更换两次，每次5分钟以透明处理。
   9. 根据上述H&E染色结果，对基因敲除组和野生型组每只小鼠的近端、中段和远端结肠组织损伤程度进行评分。
      注意： 疾病指数为黏膜层、黏膜下层、肌层和浆膜层区域的上皮损伤与炎症程度的综合评分，定义如下：0分（无组织损伤和炎症），1分（局灶性组织损伤和炎症），2分（片状组织损伤和炎症），3分（弥漫性组织损伤和炎症）。每只小鼠分别对结肠近端、中段和远端三个部位进行评分，三项得分相加得到每只动物的总分，再计算各组的平均分。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
硫酸葡聚糖钠盐（DSS）	MP Biomedicals	2160110
H&E 染色试剂盒	BBI Life Sciences	E607318
磷酸盐缓冲液（PBS）	Sangon Biotech	B548117
BD 10 ml 注射器	BD Biosciences	309604
仪器与设备
天平
剪刀
镊子
染色缸
软件
Imag-Pro Plus	Media Cybernetics, Inc.