来源：Bolívar, B. E., 等.，人单核细胞来源巨噬细胞中炎症性半胱天冬酶诱导接近现象的可视化。J. Vis. Exp. (2022)。
本视频展示了利用双分子荧光互补报告蛋白在人巨噬细胞中激活半胱天冬酶（caspase）蛋白的过程。将caspase-1的前结构域与非荧光性的Venus蛋白片段融合，这些片段可被招募至炎性小体复合物。炎性小体之间的空间接近性促使Venus片段重新折叠并产生荧光，从而证实巨噬细胞中caspase的激活。
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方法文章
人源单核细胞衍生巨噬细胞中Caspase激活的可视化
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2025年7月8日
本文内容
摘要
方案
所有涉及人类参与者的操作均按照机构、国家和国际的人类福利指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审查。
1. 人单核细胞的分离及向巨噬细胞的分化
- 从地区血库获取匿名健康个体的抗凝血，并按以下说明分离外周血单个核细胞（PBMCs）。
注意：所有步骤均须在组织培养用层流罩中进行。仅使用无菌离心管并佩戴手套。处理与血液相关的产物时，应加入10%次氯酸钠溶液。无菌磷酸盐缓冲液（PBS）（1x）或杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）（不含 Ca2+ 和 Mg2+）可互换使用。- 配制稀释缓冲液：在1x无菌PBS中添加2%胎牛血清（FBS）和0.5 mM乙二胺四乙酸（EDTA）。
- 配制培养基：在RPMI-1640培养基中添加FBS（10% (v/v)）、谷氨酰胺（2 mM）和青霉素/链霉素（50 I.U./50 µg/mL）。
- 根据制造商说明书，将运行缓冲液（材料表）预冷。
- 用两倍体积的稀释缓冲液稀释全血。使用移液管将15 mL抗凝血转移至含有30 mL稀释缓冲液的50 mL离心管中，轻轻颠倒混匀。
- 每10 mL全血或30 mL稀释后的血液，向一个空的50 mL离心管中加入15 mL密度梯度介质。
- 使用25 mL移液管，....
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结果
图 1：实验流程的示意图概览。
图 2：CD14+ 单核细胞的分化及人源MDM的转染。 （A）外周血来源的CD14+单核细胞.......
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 48孔组织培养2:34板 | Genesee Scientific | 25-108 | |
| 10 cm 组织培养皿 | VWR | 25382-166 | |
| 2-巯基乙醇 1000倍浓缩液 | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| 带1.5号高透盖玻片的8孔腔室载玻片 | Cellvis | c8-1.5H-N | |
| AutoMACS 分离柱 | Miltenyi (Biotec) | 130-021-101 | 仅用于 AutoMACS Pro 分离仪的自动化分离 |
| AutoMACS Pro 分离仪 | Miltenyi (Biotec) | 130-092-545 | 仅用于 AutoMACS Pro 分离仪的自动化分离 |
| AutoMACS Pro 洗涤液 | Miltenyi (Biotec) | 130-092-987 | 仅用于 AutoMACS Pro 分离仪的自动化分离 |
| AutoMACS 冲洗液 | Miltenyi (Biotec) | 130-091-222 | 仅用于 AutoMACS Pro 分离仪的自动化分离 |
| AutoMACS 运行缓冲液 | Miltenyi (Biotec) | 130-091-221 | 可用于 QuadroMACS 或 AutoMACS Pro 分离仪的手动或自动化分离 |
| 配备 CSU-X1A 5000 转盘单元的 Axio Observer Z1 电动倒置显微镜 | Zeiss | 任何配备激光模块（含568 nm（RFP）和488 nm或512 nm（GFP或YFP）激光线）的共聚焦显微镜均可使用 | |
| AxioObserver A1 研究级倒置显微镜 | Zeiss | 任何配备可激发568 nm（RFP）和488 nm或512 nm（GFP或YFP）波长的荧光滤光片的落射荧光显微镜均可使用 | |
| CD14+ MICROBEADS | Miltenyi (Biotec) | 130-050-201 | 可用于 QuadroMACS 或 AutoMACS Pro 分离仪的手动或自动化分离 |
| 不含氯化钙和氯化镁的DPBS | Sigma | D8537-6x500ML | |
| DsRed mito 质粒 | Clontech | 632421 | 可在 Addgene 上找到可用作荧光报告基因的类似质粒 |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher Scientific | 10437028 | |
| Ficoll-Paque PLUS 6 × 100 mL | Sigma | GE17-1440-02 | |
| GlutaMAX 补充剂（100倍浓缩液） | Thermo Fisher Scientific | 35050079 | |
| GM-CSF | Thermo Fisher Scientific | PHC2011 | |
| 血红素 BioXtra，来源于猪，纯度≥96.0%（HPLC） | Sigma | 51280-1G | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630106 | |
| 炎症性caspase BiFC质粒 | 可向LBH实验室申请获取 | ||
| LPS-EB 超纯品 | Invivogen | TLRL-3PELPS | |
| LS 柱 | Miltenyi (Biotec) | 130-042-401 | 仅用于 QuadroMACS 分离器的手动分离 |
| MACS 15 mL 管架 | Miltenyi (Biotec) | 130-091-052 | 仅用于 QuadroMACS 分离器的手动分离 |
| MACS 多功能支架 | Miltenyi (Biotec) | 130-042-303 | 仅用于 QuadroMACS 分离器的手动分离 |
| mCherry 质粒 | Yungpeng Wang 实验室 | 可在 Addgene 上找到可用作荧光报告基因的类似质粒 | |
| Neon 转染系统 | Thermo Fisher Scientific | MPK5000 | 包含 Neon 电穿孔装置、移液器和移液器工作站 |
| Neon 转染系统 10 µL 试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | MPK1096 | 包含重悬缓冲液 R、重悬缓冲液 T、电穿孔缓冲液 E、96 个 10 µL Neon 吸头和 Neon 电穿孔管 |
| 尼日尔菌素钠盐，即用型溶液 | Sigma | SML1779-1ML | |
| 青霉素-链霉素（10,000 U/mL） | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| 聚-D-赖氨酸氢溴酸盐 | Sigma | P7280-5mg | |
| QuadroMACS 分离器 | Miltenyi (Biotec) | 130-090-976 | 仅用于 QuadroMACS 分离器的手动分离 |
| qVD-OPh | Fisher (ApexBio) | 50-101-3172 | |
| RPMI 1640 培养基 | Thermo Fisher Scientific | 11875119 | |
| 胰蛋白酶-EDTA（0.25%），含酚红 | Thermo Fisher Scientific | 25200072 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA，pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15575020 |
