人源单核细胞衍生巨噬细胞中Caspase激活的可视化

摘要

来源：Bolívar, B. E., 等.，人单核细胞来源巨噬细胞中炎症性半胱天冬酶诱导接近现象的可视化。J. Vis. Exp. (2022)。

本视频展示了利用双分子荧光互补报告蛋白在人巨噬细胞中激活半胱天冬酶（caspase）蛋白的过程。将caspase-1的前结构域与非荧光性的Venus蛋白片段融合，这些片段可被招募至炎性小体复合物。炎性小体之间的空间接近性促使Venus片段重新折叠并产生荧光，从而证实巨噬细胞中caspase的激活。

方案

所有涉及人类参与者的操作均按照机构、国家和国际的人类福利指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审查。

1. 人单核细胞的分离及向巨噬细胞的分化

1. 从地区血库获取匿名健康个体的抗凝血，并按以下说明分离外周血单个核细胞（PBMCs）。
   注意：所有步骤均须在组织培养用层流罩中进行。仅使用无菌离心管并佩戴手套。处理与血液相关的产物时，应加入10%次氯酸钠溶液。无菌磷酸盐缓冲液（PBS）（1x）或杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）（不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺）可互换使用。
   1. 配制稀释缓冲液：在1x无菌PBS中添加2%胎牛血清（FBS）和0.5 mM乙二胺四乙酸（EDTA）。
   2. 配制培养基：在RPMI-1640培养基中添加FBS（10% (v/v)）、谷氨酰胺（2 mM）和青霉素/链霉素（50 I.U./50 µg/mL）。
   3. 根据制造商说明书，将运行缓冲液（材料表）预冷。
   4. 用两倍体积的稀释缓冲液稀释全血。使用移液管将15 mL抗凝血转移至含有30 mL稀释缓冲液的50 mL离心管中，轻轻颠倒混匀。
   5. 每10 mL全血或30 mL稀释后的血液，向一个空的50 mL离心管中加入15 mL密度梯度介质。
   6. 使用25 mL移液管，缓慢而稳定地将步骤1.1.5中的密度梯度介质上层覆盖30 mL稀释后的血液。保持移液管尖端紧贴管壁，并将离心管倾斜一定角度。
   7. 小心将离心管转移至水平转子离心机中，避免扰动两相界面。在室温（RT）下以400 × g离心25分钟，加速度和减速度设为最小值。
   8. 使用10 mL移液管小心吸除上层（透明）血浆层，并将其弃入含10%次氯酸钠的废液容器中。
   9. 使用10 mL移液管收集外周血单个核细胞（PBMCs）的中间相（白色层，图1），转移至新的50 mL离心管中。将同一供体不同离心管中的白色层合并至一个50 mL离心管中，总体积不超过30 mL。
   10. 用步骤1.1.1中的稀释缓冲液将每管体积补至50 mL，在4 °C下以300 × g离心10分钟。使用10 mL移液管吸除上清液，并将其弃入含10%次氯酸钠的废液容器中。
   11. 使用p1000移液器将每个细胞沉淀重悬于1 mL步骤1.1.3中预冷的运行缓冲液中。将同一供体的细胞悬液合并至新的15 mL离心管中，用预冷的运行缓冲液将每管体积补至15 mL，并轻轻颠倒混匀。
   12. 取20 µL步骤1.1.11中的细胞悬液，用1x无菌PBS进行1:100稀释。使用血细胞计数板测定细胞数量。
   13. 在4 °C下以300 × g离心步骤1.1.11中的细胞悬液10分钟，使用10 mL移液管吸除上清液。如有必要，使用p200移液器彻底去除残留上清液。
   14. 每1 × 10⁷个细胞加入80 µL预冷的MACS运行缓冲液重悬分离得到的PBMCs，缓冲液总量最多不超过800 µL。
   15. 每1 × 10⁷个细胞加入20 µL抗人CD14微珠（MicroBeads），或每份血液样本（约100 mL未稀释血液）最多加入100 µL。轻轻颠倒混匀后，置于4 °C旋转仪上持续混匀20分钟。
   16. 从旋转仪上取下样本，每管加入10 mL预冷的运行缓冲液，在4 °C下以300 × g（加速度=5，减速度=5）离心10分钟。
   17. 使用10 mL移液管吸除上清液，并将最多1 × 10⁸个细胞重悬于500 µL预冷的运行缓冲液中（浓度为2 × 10⁸/mL）。
   18. 根据制造商说明书，使用手动或自动系统（材料表）通过磁性细胞分选法分离CD14阳性细胞。
   19. CD14阳性细胞分选后，取20 µL步骤1.1.18中的细胞悬液，用1x无菌PBS进行1:100稀释。通过血细胞计数板计数确定细胞数量。
   20. 在室温下以300 × g离心CD14阳性细胞10分钟。使用10 mL移液管或真空系统吸除上清液。
   21. 将步骤1.1.20中的细胞沉淀重悬于步骤1.1.2中预热的培养基中，最终细胞密度为1 × 10⁷个细胞/mL。
2. 将分离得到的CD14阳性单核细胞以5 × 10⁶个细胞的密度接种。
   1. 在10 cm组织培养皿中加入10 mL步骤1.1.2中的培养基，并补充50 ng/mL粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）。
   2. 将0.5 mL步骤1.1.21中的细胞悬液逐滴加入培养基中，轻轻旋转培养皿混匀。在加湿的组织培养孵箱（37 °C，5% CO₂）中过夜培养。
   3. 次日，使用真空系统吸除培养基，去除未贴壁的细胞。加入10 mL新鲜培养基并补充GM-CSF（50 ng/mL），在加湿的组织培养孵箱（37 °C，5% CO₂）中继续培养7天，以完成完全分化（参见图2A，了解GM-CSF条件下CD14+单核细胞在不同分化阶段的形态）。每2–3天更换一次培养基，并每次补充新鲜GM-CSF（50 ng/mL）。

2. 电穿孔组分的制备

注意：本实验方案适用于 10 µL Neon 尖端（材料表）。每次转染使用 1-2 × 10⁵ 个细胞。建议将转染后的细胞接种于 48 孔板或 8 孔培养板（每孔加入 10 µL 转染细胞）。可使用不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 1× 无菌 DPBS 替代 PBS。

1. 第7天，通过在RPMI-1640培养基中添加FBS（10% (v/v)）和GlutaMAX（2 mM），制备无抗生素培养基。
2. 将无血清RPMI-1640培养基、胰蛋白酶-EDTA（0.25%）溶液、1×无菌PBS（不含Ca²⁺和Mg²⁺）以及步骤1.1.2中的完全培养基置于37 °C水浴中预热。
3. 若使用玻璃底培养皿（用于共聚焦显微镜观察），需用聚-D-赖氨酸氢溴化物包被培养皿。
   1. 向8孔腔室培养皿中加入200 µL聚-D-赖氨酸氢溴化物溶液（0.1 mg/mL溶于1×无菌PBS），室温孵育5分钟。
   2. 吸除聚-D-赖氨酸溶液，用1×无菌PBS洗涤玻璃表面一次，吸除PBS后进行步骤2.4。
4. 向48孔板或8孔腔室培养皿的每孔中加入200 µL无抗生素培养基，在湿润的组织培养箱（37 °C，5% CO₂）中预孵育，直至准备接种转染后的细胞。

3. 电穿孔细胞的制备

注意：在7天分化期结束时，从一个10 cm培养皿中获得的MDM产量约为1.5 × 10⁶ 个细胞。可使用不含Ca²⁺和Mg²⁺的1×无菌DPBS替代PBS。本方案已优化，可在维持细胞活力和完整性的前提下使大多数巨噬细胞从培养板上脱落。MDM难以从细胞培养板上脱离，因此可能需要重复步骤3.2和3.3两次以充分解离细胞。确保每次使用胰蛋白酶-EDTA（0.25%）孵育的时间不超过5分钟。

1. 从10 cm培养皿中完全分化的巨噬细胞中吸除培养基，并用预热的无血清RPMI-1640培养基洗涤细胞单层。确保彻底去除培养基。
2. 每10 cm培养皿加入2 mL预热的0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，于湿润的组织培养箱（37 °C，5% CO₂）中孵育5分钟，以收获细胞。
3. 使用P1000移液器，将0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液在培养皿表面轻柔吹打数次，使细胞完全脱落。将细胞悬液转移至含有5 mL步骤1.1.2中预热的完全培养基的15 mL锥形管中。
4. 将培养皿置于明场显微镜下，观察多个视野中的细胞脱落情况。若仍有大量细胞附着，重复步骤3.2–3.3。
5. 在室温下以250 × g 离心5分钟，收集细胞。
6. 吸除上清液，将细胞重悬于10 mL预热至37 °C的1×无菌PBS中。取20 µL细胞悬液，使用血细胞计数板测定细胞数量。
7. 按每组转染所需取1–2 × 10⁵个细胞，置于15 mL离心管中。用预热的1×无菌PBS补至终体积15 mL，在室温下以250 × g 离心5分钟。
8. 吸除PBS后，再以250 × g 短暂离心1分钟，使用P200移液器彻底去除细胞沉淀中残留的PBS。

4. 将半胱天冬酶 BiFC 组分转染至人单核细胞来源的巨噬细胞

注意：本实验步骤使用 Neon 转染系统（材料表）进行。本方案描述了使用 10 µL Neon 尖端（材料表）转染 1-2 × 10⁵ 个细胞的操作步骤。若使用 100 µL Neon 尖端，请相应放大试剂用量。避免细胞在重悬缓冲液 R 中暴露超过 15 分钟，否则可能导致细胞活力和转染效率下降。

1. 将报告质粒（例如 mCherry 或 dsRedmito，浓度为 100 ng/µL）用无核酸酶水或 0.5x TE 缓冲液稀释，以便观察转染的细胞。
2. 将半胱天冬酶 BiFC 质粒用无核酸酶水或 0.5x TE 缓冲液稀释至适当浓度，使质粒总体积不超过总转染体积 10 µL 的 30%（例如 C1 Pro-VC 为 300 ng/µL，C1 Pro-VN 为 300 ng/µL）。
3. 为每次预期的转染准备一支 1.5 mL 无菌微量离心管，加入适量的报告质粒（例如 50 ng 或 0.5 µL）和半胱天冬酶 BiFC 质粒（例如 C1 Pro-VC 300 ng 或 1 µL，C1 Pro-VN 片段 300 ng 或 1 µL）。始终将微量离心管置于超净台内。
4. 将移液工作站、设备、枪头、电穿孔管和移液器置于无菌超净工作台中。
   注意： 移液工作站、设备、枪头、电穿孔管和移液器均包含在 Neon 转染系统中。
5. 根据制造商说明，将移液工作站上的高压和传感器连接器连接至设备背面的接口。将移液工作站放置在设备附近。
6. 将电源线插入设备背面的交流电源输入口，并将设备连接至电源插座。按下电源开关以开启设备。
7. 在设备开启并正确连接后，于启动界面输入转染参数。点击 电压（Voltage），输入 1000，然后点击 完成（Done），将电压设为 1000 V。点击 脉宽（Width），输入 40，然后点击 完成（Done），将脉冲持续时间设为 40 ms。最后点击 脉冲次数（# Pulses），输入 2，然后点击 完成（Done），将电脉冲次数设为 2 次。
8. 取一支试剂盒中提供的电穿孔管，在室温下加入 3 mL 电解缓冲液 E（适用于 10 µL 枪头，由试剂盒提供）。将电穿孔管插入移液工作站的移液管架中。确保管壁上的电极朝向内侧，并在插入时听到“咔哒”声。
9. 取步骤 3.8 中获得的细胞沉淀，每 1–2 × 10⁵ 个细胞加入 10 µL 预热的重悬缓冲液 R（由试剂盒提供）。用 p20 微量移液器轻轻混匀。将 10 µL 细胞悬液加入步骤 4.3 中准备好的每支电穿孔管中，并用 p20 微量移液器轻轻混匀。
10. 取移液器，通过按下 Push 按钮至第二档安装枪头。确保夹具完全夹住枪头内活塞的安装杆，且移液器顶部无间隙。
11. 吸取样品时，将移液器的 Push 按钮按至第一档，将其浸入装有细胞/质粒 DNA 混合物的第一支管中。缓慢将混合物吸入移液器枪头。
    注意： 避免产生气泡，因为气泡可能导致电穿孔过程中发生电弧放电；若设备检测到气泡，可能阻止电脉冲的传递。若观察到气泡，应将内容物排回管中，并重新尝试吸取。
12. 将含有样品的移液器非常小心地插入移液管架中。确保移液器卡入到位并正确放置。
13. 按下触摸屏上的 开始（Start） 按钮，等待电脉冲完成传递。屏幕上的消息将提示操作完成。
14. 缓慢将移液器从工作站中取出，并立即通过缓慢按下 Push 按钮至第一档，将转染后的细胞悬液加入对应孔中，孔内已含有步骤 2.4 中预热的无抗生素培养基。
    注意： 此枪头可用于同一质粒最多三次；否则，应通过按下 Push 按钮至第二档，将枪头丢弃至生物危害废物容器中。
15. 对每支含有细胞/质粒 DNA 混合物的电穿孔管重复执行步骤 4.10–4.14。
16. 轻轻摇动含有转染细胞的培养板，并在加湿的组织培养孵育箱（37 °C，5% CO₂）中孵育 1–3 小时。
17. 向每孔中加入 200 µL 步骤 1.1.2 中预热的培养基（完全培养基）。再次将培养皿放入加湿的组织培养孵育箱（37 °C，5% CO₂）中。让细胞至少表达基因 24 小时。
18. 次日，使用落射荧光显微镜检查细胞活力和转染效率。
    1. 根据制造商说明，打开落射荧光显微镜和荧光光源箱，将培养皿放置在显微镜载物台上。
    2. 选择 10x 或 20x 物镜以及 568 nm（RFP）滤光片。
    3. 为评估细胞活力，按下 透射光 LED（TL） 按钮，以观察所选视野中的所有细胞。通过显微镜目镜观察时，旋转调焦旋钮直至看到细胞，并检查所选视野中细胞的贴壁情况。
       注意： 完全贴壁的细胞代表活细胞，而悬浮的细胞代表非活细胞。如果孔内汇合度过高，未贴壁细胞的存在可能是由于细胞数量估算过高，而非活力低下所致。然而，低汇合度伴随大量悬浮细胞则表明细胞活力低下，可能由电穿孔过程中的电弧放电、质粒毒性或重悬缓冲液 R 的过度暴露引起。不应使用表现出后一种情况的孔。
    4. 为评估转染效率，如上所述在透射光下对所选视野中的细胞进行调焦。计数所选视野中的总细胞数。关闭 透射光 LED（TL） 开关，按下 反射光 LED 按钮（RL） 开启荧光。
    5. 精细调焦以观察报告基因的荧光（红色细胞），并计数红色荧光细胞的总数。对每孔至少再重复步骤（4.18.4–4.18.5）两次。

5. 转染MDM的处理及caspase BiFC数据采集

注意：如果计划使用落射荧光显微镜或共聚焦显微镜对细胞进行成像，建议在施加选定刺激前1小时使用qVD-OPh（20 µM）处理，以防止半胱天冬酶（caspase）依赖性细胞死亡（主要是凋亡）。在成像过程中使用该处理可防止细胞因凋亡而从培养表面脱落，从而避免细胞移出焦平面导致难以成像。需要注意的是，caspase向活化平台的募集及其相关的caspase双分子荧光互补（BiFC）不依赖于caspase的催化活性，因此caspase抑制不会影响该步骤。

1. 转染后约24小时加入选定的刺激物，并根据每种药物的要求孵育相应时间。
   1. 通过在步骤1.1.2的培养基中添加HEPES（20 mM，pH 7.2–7.5）和2-巯基乙醇（55 µM）来制备成像培养基。
   2. 将所需浓度的刺激物加入预热的成像培养基中，轻轻混匀。
   3. 用p1000移液器小心吸除细胞中的培养基，沿孔壁缓慢加入500 µL步骤5.1.2中的刺激物溶液。
   4. 对于未处理的对照孔，加入不含刺激物的成像培养基。
   5. 将细胞置于加湿的组织培养孵箱中（37 °C，5% CO₂），根据各处理条件指定的时间进行孵育。
2. 使用落射荧光显微镜或共聚焦显微镜观察细胞。
   1. 按照制造商的说明打开显微镜和荧光光源。
   2. 选择10倍或20倍物镜，将培养皿放置在显微镜载物台上。
   3. 通过显微镜目镜，在568 nm滤光片下寻找细胞，并聚焦于表达dsRedmito/mCherry报告基因的细胞（红色细胞）。
   4. 计数视野内所有红色细胞，并记录数量。
   5. 在同一视野下，切换至488 nm或512 nm滤光片（GFP或YFP），继续计数同时呈绿色的红色细胞（Venus阳性或BiFC阳性细胞），并记录数量。
   6. 从至少三个独立的视野中，计数不少于100个dsRedmito/mCherry阳性细胞。

结果

图 1：实验流程的示意图概览。

图 2：CD14+ 单核细胞的分化及人源MDM的转染。 （A）外周血来源的CD14+单核细胞...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
48孔组织培养2:34板	Genesee Scientific	25-108
10 cm 组织培养皿	VWR	25382-166
2-巯基乙醇 1000倍浓缩液	Thermo Fisher Scientific	21985023
带1.5号高透盖玻片的8孔腔室载玻片	Cellvis	c8-1.5H-N
AutoMACS 分离柱	Miltenyi (Biotec)	130-021-101	仅用于 AutoMACS Pro 分离仪的自动化分离
AutoMACS Pro 分离仪	Miltenyi (Biotec)	130-092-545	仅用于 AutoMACS Pro 分离仪的自动化分离
AutoMACS Pro 洗涤液	Miltenyi (Biotec)	130-092-987	仅用于 AutoMACS Pro 分离仪的自动化分离
AutoMACS 冲洗液	Miltenyi (Biotec)	130-091-222	仅用于 AutoMACS Pro 分离仪的自动化分离
AutoMACS 运行缓冲液	Miltenyi (Biotec)	130-091-221	可用于 QuadroMACS 或 AutoMACS Pro 分离仪的手动或自动化分离
配备 CSU-X1A 5000 转盘单元的 Axio Observer Z1 电动倒置显微镜	Zeiss		任何配备激光模块（含568 nm（RFP）和488 nm或512 nm（GFP或YFP）激光线）的共聚焦显微镜均可使用
AxioObserver A1 研究级倒置显微镜	Zeiss		任何配备可激发568 nm（RFP）和488 nm或512 nm（GFP或YFP）波长的荧光滤光片的落射荧光显微镜均可使用
CD14+ MICROBEADS	Miltenyi (Biotec)	130-050-201	可用于 QuadroMACS 或 AutoMACS Pro 分离仪的手动或自动化分离
不含氯化钙和氯化镁的DPBS	Sigma	D8537-6x500ML
DsRed mito 质粒	Clontech	632421	可在 Addgene 上找到可用作荧光报告基因的类似质粒
胎牛血清	Thermo Fisher Scientific	10437028
Ficoll-Paque PLUS 6 × 100 mL	Sigma	GE17-1440-02
GlutaMAX 补充剂（100倍浓缩液）	Thermo Fisher Scientific	35050079
GM-CSF	Thermo Fisher Scientific	PHC2011
血红素 BioXtra，来源于猪，纯度≥96.0%（HPLC）	Sigma	51280-1G
HEPES	Thermo Fisher Scientific	15630106
炎症性caspase BiFC质粒			可向LBH实验室申请获取
LPS-EB 超纯品	Invivogen	TLRL-3PELPS
LS 柱	Miltenyi (Biotec)	130-042-401	仅用于 QuadroMACS 分离器的手动分离
MACS 15 mL 管架	Miltenyi (Biotec)	130-091-052	仅用于 QuadroMACS 分离器的手动分离
MACS 多功能支架	Miltenyi (Biotec)	130-042-303	仅用于 QuadroMACS 分离器的手动分离
mCherry 质粒	Yungpeng Wang 实验室		可在 Addgene 上找到可用作荧光报告基因的类似质粒
Neon 转染系统	Thermo Fisher Scientific	MPK5000	包含 Neon 电穿孔装置、移液器和移液器工作站
Neon 转染系统 10 µL 试剂盒	Thermo Fisher Scientific	MPK1096	包含重悬缓冲液 R、重悬缓冲液 T、电穿孔缓冲液 E、96 个 10 µL Neon 吸头和 Neon 电穿孔管
尼日尔菌素钠盐，即用型溶液	Sigma	SML1779-1ML
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）	Thermo Fisher Scientific	15140122
聚-D-赖氨酸氢溴酸盐	Sigma	P7280-5mg
QuadroMACS 分离器	Miltenyi (Biotec)	130-090-976	仅用于 QuadroMACS 分离器的手动分离
qVD-OPh	Fisher (ApexBio)	50-101-3172
RPMI 1640 培养基	Thermo Fisher Scientific	11875119
胰蛋白酶-EDTA（0.25%），含酚红	Thermo Fisher Scientific	25200072
UltraPure 0.5 M EDTA，pH 8.0	Thermo Fisher Scientific	15575020