人单核细胞来源的巨噬细胞中 Caspase 活化的可视化

Abstract

来源:Bolívar， B. E.， et al.， 炎性半胱天冬酶诱导的人单核细胞衍生巨噬细胞接近的可视化。J. Vis. Exp. （2022 年）。

该视频演示了使用双分子荧光互补报告基因蛋白在人巨噬细胞中激活 caspase 蛋白。caspase-1 的前结构域与 Venus 蛋白的非荧光片段融合，这些片段被募集到炎性小体复合物中。炎性小体的接近诱导 Venus 片段的复性和荧光，证实巨噬细胞中的 caspase 激活。

Protocol

所有涉及人类参与者的程序均已按照机构、国家和国际人类福利指南执行，并已由当地机构审查委员会审查。

1. 分离人单核细胞并分化为巨噬细胞

1. 从区域血库中去标识化的健康个体中获取抗凝血，并分离外周血单核细胞 （PBMC），如下所示
   注意:在组织培养层流罩中执行所有步骤。仅使用无菌试管并戴上手套。弃置时，向所有与血液相关的产品中加入 10% 的漂白剂。无菌磷酸盐缓冲盐水 （PBS） （1x） 或 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （DPBS）（不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺）可以互换使用。
   1. 制备稀释缓冲液:用 2% 胎牛血清 （FBS） 和 0.5 mM 乙二胺四乙酸 （EDTA） 补充 1x 无菌 PBS。
   2. 准备培养基:用 FBS （10% （v/v））、谷氨酰胺 （2 mM） 和青霉素/链霉素 （50 IU/50 μg/mL） 补充 RPMI-1640 培养基
   3. 根据制造商的方案预冷运行缓冲液（材料表）。
   4. 用两倍体积的稀释缓冲液稀释全血。使用血清移液管，将 15 mL 抗凝血转移到含有 30 mL 稀释缓冲液的 50 mL 试管中。倒置轻轻混合。
   5. 对于每 10 mL 全血或 30 mL 稀释血液，向 50 mL 空管中加入 15 mL 密度梯度培养基。
   6. 使用 25 mL 血清移液管缓慢稳定地将步骤 1.1.5 中的密度梯度培养基与 30 mL 稀释血液分层。保持移液管的尖端靠在试管壁上，并使试管保持倾斜的角度。
   7. 小心地将试管转移到摆动桶离心机中。避免打扰这两个阶段。在室温 （RT） 下以 400 x g 离心管 25 分钟，并将加速和减速设置为最小值。
   8. 使用 10 mL 移液管小心去除顶部（透明）血浆层，并将其丢弃在装有漂白剂 （10%） 的容器中。
   9. 用 10 mL 移液管收集外周血单核细胞（PBMC，图 1）的间期（白色）层，并转移到新的 50 mL 试管中。将来自同一供体的不同试管的白色层混合在 50 mL 至 30 mL 的试管中。
   10. 使用步骤 1.1.1 中的稀释缓冲液使每个试管的总体积为 50 mL，并在 300 x g 和 4 °C 下离心 10 分钟。用 10 mL 移液管去除上清液，并将其丢弃在装有漂白剂 （10%） 的容器中。
   11. 使用 p1000 微量移液器将每个细胞沉淀重悬于步骤 1.1.3 中预冷的 1 mL 运行缓冲液中。将来自同一供体的细胞悬液混合到新的 15 mL 试管中。用预冷的电泳缓冲液将每管的体积调至 15 mL，并倒置充分混合。
   12. 从步骤 1.1.11 中取出 20 μL 细胞悬液等分试样，并使用 1x 无菌 PBS 制备 1:100 稀释液。使用血细胞计数器确定细胞数量。
   13. 将步骤 1.1.11 中的细胞悬液在 300 x g 和 4 °C 下离心 10 分钟，然后用 10 mL 移液管去除上清液。如有必要，使用 p200 微量移液器完全去除上清液。
   14. 对于每个 1 x 10⁷ 个细胞，将分离的 PBMC 重悬于 80 μL 预冷的 MACS 电泳缓冲液中，最多添加 800 μL 缓冲液。
   15. 每个 1 x 10⁷ 个细胞添加 20 μL 抗人 CD14 微珠，或每个血液样品最多添加 100 μL（~100 mL 未稀释血液）。倒置充分混合，并置于管旋转器上 20 分钟，并在 4 °C 下连续混合。
   16. 从试管旋转器中取出样品，向每个试管中加入 10 mL 预冷的运行缓冲液，并在 300 x g （加速度 = 5，减速 = 5） 和 4 °C 下离心 10 分钟。
   17. 用 10 mL 移液管去除上清液，并在 500 μL 预冷的电泳缓冲液 （2 x 10⁸/mL） 中重悬至多 1 x 10⁸ 个细胞。
   18. 根据制造商的说明，使用手动或自动系统（材料表）通过磁性细胞分选来分离 CD14 阳性细胞。
   19. 在 CD14 阳性选择后，从步骤 1.1.18 中取出 20 μL 细胞悬液等分试样，并使用 1x 无菌 PBS 制备 1:100 稀释液。通过在血细胞计数器上计数细胞来确定细胞数。
   20. 将 CD14 阳性细胞以 300 x g 和 RT 离心 10 分钟。使用 10 mL 移液管或真空系统去除上清液。
   将
   21. 步骤 1.1.20 中的细胞沉淀重悬于步骤 1.1.2 中预热的培养基中，至最终细胞密度为 1 x 10⁷ 个细胞/mL。
2. 以 5 x 10⁶ 个细胞的细胞密度接种分离的 CD14 阳性单核细胞。
   1. 在 10 cm 组织培养皿上，加入 10 mL 步骤 1.1.2 中的培养基，并补充有 50 ng/mL 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 （GM-CSF）。
   2. 将步骤 1.1.21 中的 0.5 mL 细胞悬液滴加到培养基中，然后轻轻旋转板。将细胞在加湿的组织培养箱（37°C，5% CO_{2 ）}中孵育过夜。
   3. 第二天，使用真空系统吸出培养基，以去除过夜未粘附的细胞。加入 10 mL 补充 GM-CSF 的新鲜培养基 （50 ng/mL），并将细胞在加湿的组织培养箱（37 °C，5% CO₂ ）中孵育 7 天，以允许完全分化（参见图 2A 了解 GM-CSF 中不同分化阶段 CD14 + 单核细胞的外观）。每 2-3 天更换一次培养基，每次补充新鲜的 GM-CSF （50 ng/mL）。

2. 电穿孔组分的制备

注意:该方案专为 10 μL-Neon 吸头设计（材料表）。对于每次转染，使用 1-2 x 10⁵ 个细胞。建议将转染细胞接种在 48 孔板或 8 孔腔室培养皿上（每孔 10 μL 转染细胞）。可以使用 1x 无菌 DPBS（不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺）代替 PBS。

1. 第 7 天，通过在 RPMI-1640 培养基中补充 FBS （10 % （v/v）） 和谷氨酰胺 （2 mM） 来制备无抗生素培养基。
2. 将无血清RPMI-1640培养基、胰蛋白酶-EDTA（0.25%）溶液、1x无菌PBS（不含Ca²⁺和Mg²⁺）和步骤1.1.2中的完全培养基置于37°C水浴中。
3. 如果使用玻璃底培养皿（用于共聚焦显微镜），则用聚-D-赖氨酸氢溴酸盐涂覆培养皿。
   1. 用 200 μL 多聚-D-赖氨酸氢溴酸盐（0.1 mg/mL 在 1x 无菌 PBS 中）包被 8 孔室培养皿，并在室温下孵育 5 分钟。
   2. 吸出聚-D-赖氨酸溶液，并用 1x 无菌 PBS 洗涤玻璃杯一次。吸出 PBS 并继续执行步骤 2.4。
4. 在 48 孔板或 8 个孔室培养皿中每孔添加 200 μL 不含抗生素的培养基，并在加湿的组织培养箱（37 °C，5% CO₂ ）中预孵育，直到准备好接种转染的细胞。

3. 电穿孔细胞的制备

注意:在 7 天分化期结束时，来自 10 cm 培养皿的 MDM 产量约为 1.5 x 10⁶ 个细胞。1x 无菌 DPBS（不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺）可用于代替 PBS。该方案经过优化，使大多数巨噬细胞从板中分离，同时保持细胞活力和完整性。MDM 很难从细胞培养板上分离。因此，可能需要执行步骤 3.2 和 3.3 两次以解离细胞。确保每次与胰蛋白酶-EDTA （0.25%） 孵育的时间不超过 5 分钟。

1. 在 10 cm 培养皿上从完全分化的巨噬细胞中吸出培养基，并用温热的无血清 RPMI-1640 培养基洗涤细胞单层。确保完全去除培养基。
2. 通过每 10 cm 培养皿添加 2 mL 温胰蛋白酶-EDTA （0.25%） 溶液收获细胞，并在加湿组织培养箱（37 °C，5% CO_{2 ）}中孵育 5 分钟。
3. 使用 p1000 微量移液器在整个培养皿区域上轻轻上下移液胰蛋白酶-EDTA （0.25%） 溶液，完成细胞分离。将细胞悬液转移到含有 5 mL 步骤 1.1.2 中温热完全培养基的 15 mL 锥形管中。
4. 将培养皿带到明场显微镜下，检查各种视野中的细胞脱离。如果仍附着大量细胞，请重复步骤 3.2-3.3。
5. 在 RT 下以 250 x g 离心细胞悬液 5 分钟。
6. 吸出培养基并将细胞重悬于 10 mL 预热至 37 °C 的 1x 无菌 PBS 中。取 20 μL 等分试样，使用血球计数器测定细胞数量。
7. 每次预期转染取 1-2 x 10⁵ 个细胞，并置于 15 mL 试管中。用预热的 1x 无菌 PBS 使最终体积为 15 mL。在 RT 下以 250 x g 离心 5 分钟。
8. 吸出 PBS 并以 250 x g 的速度再离心 1 分钟。使用 p200 微量移液器从细胞沉淀中去除任何残留的 PBS。

4. 半胱天冬酶 BiFC 成分对人单核细胞衍生的巨噬细胞进行核转染

注意:该方案的这一部分使用 Neon 转染系统（材料表）进行。该方案概述了使用 10 μL Neon 吸头转染 1-2 x 10⁵ 个细胞的步骤（材料表）。如果使用 100 μL Neon 吸头，请相应地放大。避免将细胞暴露于重悬缓冲液 R 中超过 15 分钟，因为这可能会降低细胞活力和转染效率。

1. 用无核酸酶的水或 0.5x TE 缓冲液稀释报告质粒（即 100 ng/μL 的 mCherry 或 dsRedmito），以观察转染的细胞。
2. 在无核酸酶水或 0.5x TE 缓冲液中将半胱天冬酶 BiFC 质粒稀释至适当浓度，使质粒总体积不超过 10 μL 总转染体积的 30%（即 300 ng/μL 的 C1 Pro-VC 和 300 ng/μL 的 C1 Pro-VN）。
3. 每次预期转染制备 1.5 mL 无菌微管，并添加适量的报告质粒（即 50 ng 或 0.5 μL）和 caspase BiFC 质粒（即 300 ng 或 1 μL C1 Pro-VC 和 300 ng 或 1 μL C1 Pro-VN 片段）。始终将微管放在引擎盖中。
4. 将移液器站、装置、吸头、电穿孔管和移液器放入无菌层流罩中><。 注意:移液器站、装置、吸头、电穿孔管和移液器都包含在 Neon 转染系统中。
5. 按照制造商的说明，将移液器站上的高压和传感器连接器连接到设备的后部端口。使移液器站靠近设备。
6. 将电源线连接到后部交流电源插座，然后继续将设备连接到电源插座。按下电源开关以打开设备。
7. 在设备开机并正确连接时显示的启动屏幕中输入转染参数。按电压，输入 1000，然后按 Done 将电压设置为 1000 V。按宽度，输入 40，然后按完成将脉冲持续时间设置为 40 毫秒。最后，按 # Pulses，输入 2，然后按 Done 将电脉冲数设置为 2。
8. 取一根电穿孔管（试剂盒中提供），在 RT 下填充 3 mL 电解缓冲液 E（用于 10 μL 吸头，试剂盒中提供），将电穿孔管插入移液器站上的移液器支架中。确保管侧面的电极朝内，并且在插入管子时会听到咔嗒声。
9. 取步骤 3.8 中的细胞沉淀，为每 1-2 x 10⁵ 个细胞添加 10 μL 预热的重悬 R 缓冲液（试剂盒中提供）。用 p20 微量移液器轻轻混合。向步骤 4.3 中设置的每个试管中加入 10 μL 细胞悬液，并用 p20 微量移液器轻轻混合。
10. 拿起移液器，按下第二个挡块上的按钮插入吸头。确保夹具完全拾取吸头中活塞的安装杆，并且在移液器的顶部头上没有观察到间隙。
11. 要吸出样品，请按下移液器上的按钮至第一个停止点，然后将其浸入含有细胞/质粒 DNA 混合物的第一管中。将混合物缓慢吸入移液器吸头中。
    注意:避免气泡，因为它们会在电穿孔过程中引起电弧，如果被设备检测到，可能会阻止电脉冲的传递。如果观察到气泡，请将内容物释放到试管中，然后再次尝试吸液。
12. 将装有样品的移液器非常小心地插入移液器支架。确保移液器发出咔嗒声并正确放置。
13. 按触摸屏上的开始，然后等待电脉冲传递。屏幕上会显示一条消息，指示完成。
14. 从工作站上缓慢取出移液管，然后通过缓慢按下按钮到第一个停止点，立即将转染的细胞悬液加入到步骤 2.4 中预热的无抗生素培养基的相应孔中><。 注意:对于同一质粒，该 tip 最多可重复使用 3 次;否则，按下第二个停止点的按钮，将其丢弃到生物危害废物容器中。
15. 对每个含有细胞/质粒 DNA 混合物的试管重复步骤 4.10-4.14。
16. 用转染的细胞轻轻摇动板，并在加湿的组织培养箱（37°C，5% CO_{2 ）}中孵育 1-3 小时。
17. 向每个孔中加入 200 μL 步骤 1.1.2 中预热的培养基（完全培养基）。再次将培养皿放入加湿的组织培养箱（37°C，5% CO_{2 ）}中。允许至少 24 小时进行基因表达。
18. 第二天，使用落射荧光显微镜检查细胞活力和转染效率。
    1. 按照制造商的说明打开落射荧光显微镜和荧光光源盒，并将培养皿放在显微镜载物台上。
    2. 选择 10 倍或 20 倍物镜和 568 nm （RFP） 滤光片。
    3. 要估计细胞活力，请按透射光 LED （TL） 按钮以可视化所选区域中的所有细胞。在观察显微镜目镜时，转动对焦旋钮直到观察到细胞，并检查所选视野中的细胞附着。
       注意:完全贴壁的细胞代表活细胞，而漂浮的细胞代表非活细胞。如果孔的汇合度很高，则未贴壁细胞的存在可能是高估细胞数量的结果，而不是活力低的结果。然而，低汇合度伴随着高含量的漂浮细胞意味着低活力，这可能是由于电穿孔过程中的电弧、质粒毒性或过度暴露于重悬 R 缓冲液引起的。不要使用显示后一种行为的井。
    4. 要估计转染效率，如上所述，在透射光下关注所选区域中的细胞。计算所选字段中的单元格总数。在透射光 LED （TL） 关闭的情况下，按下反射光 LED 按钮 （RL） 打开。
    5. 精细聚焦报告基因荧光（红细胞）并计数红色荧光细胞的总数。对每个孔至少再有两个字段重复这些步骤 （4.18.4-4.18.5）。

5. 转染 MDM 和 caspase BiFC 数据采集的处理

注意:如果计划使用落射荧光或共聚焦显微镜对细胞进行成像，建议在用所选刺激物处理之前用 qVD-OPh （20 μM） 处理 1 小时，以防止 caspase 依赖性细胞死亡（主要是细胞凋亡）。这用于成像，以防止细胞因细胞凋亡而脱落，从而使它们在离开焦平面时很难成像。请注意，半胱天冬酶募集到激活平台和相关的半胱天冬酶 BiFC 不依赖于半胱天冬酶的催化活性，因此，半胱天冬酶抑制不会影响此步骤。

1. 转染后约 24 小时用选定的刺激物处理，并根据每种药物的需要孵育多长时间。
   1. 通过在步骤 1.1.2 中的培养基中补充 Hepes （20 mM，pH 7.2-7.5） 和 2-巯基乙醇 （55 μM） 来制备成像培养基。
   2. 将所需浓度的刺激物添加到预热的成像介质中并轻轻混合。
   3. 用 p1000 微量移液器小心地从细胞中取出培养基，并在孔的一侧加入 500 μL 步骤 5.1.2 中的刺激溶液。
   4. 要运行未处理的对照孔，请添加无刺激的成像培养基。
   5. 将细胞在加湿的组织培养箱（37°C，5% CO_{2 ）}中孵育，只要每次处理指示即可。
2. 使用落射荧光或共聚焦显微镜观察细胞。
   1. 按照制造商的说明打开显微镜和荧光光源。
   2. 选择 10 倍或 20 倍物镜，将培养皿放在显微镜载物台上。
   3. 使用显微镜目镜，找到 568 nm 滤光片下的细胞，并聚焦于表达 dsRedmito/mCherry 报告基因的细胞（红细胞）。
   4. 计数视野中的所有红色细胞并记录数量。
   5. 在同一视野中，更改为 488 或 512 过滤器（GFP 或 YFP），继续计算同样为绿色（Venus 阳性或 BiFC 阳性）的红细胞数量，并记录数量。
   6. 从至少三个单独的视野中计数至少 100 个 dsRedmito/mCherry 阳性细胞。

Results

图 1:实验工作流程的示意图。

图 2:CD14 单核细胞的分化和人 MDM 的转染。（A） 在分化第 1 天、第 3 天、第 4 天和第 7 天暴露于 GM-CSF 的外周血中 CD14 + 单核细胞的代表性明场图像（比例尺，100 μm）。（B-C）用 caspase-1 pro-BiFC 对和转染报告基因 dsRedmito（50 ng，红色）转染人 MDM。24 小时后，用和不用 LPS （100 ng/...

Materials