一种用于研究宿主-微生物群相互作用的离体肠道器官培养系统

摘要

来源：Azriel, S.，等。一种用于分析宿主-微生物群相互作用的肠道类器官培养系统。视觉化实验杂志 (2021)。

在本视频中，我们介绍了建立一个 离体 用于研究小鼠肠组织片段与特定肠道细菌相互作用的肠道器官培养系统。该装置包含两对进出液端口，第一对连接肠组织管腔并将其与特定细菌悬液相连，第二对持续向装置的孔中供给培养基以维持 离体 组织活力

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 实验准备

1. 肠道类器官培养装置的制备（3天）
   1. 使用3D打印机打印可重复使用的类器官培养装置塑料模具（该装置包含6个孔，24个大小孔洞，以及装置盖子）。
      注意：这些塑料模具可用于制备多个装置。
   2. 将钝端针头（22 G 和 18 G）插入装置模具中相应位置，并为一套装置及盖子浇注约20 g的聚二甲基硅氧烷（PDMS）混合物（基础剂与催化剂质量比为1:10）。
   3. 将模具置于真空腔中30分钟，以去除PDMS混合物中的气泡。
   4. 将模具在55 °C下孵育过夜，以完成PDMS的聚合。
   5. PDMS固化后，从模具中拔出针头，并小心地将培养装置和盖子从塑料模具中取出。
   6. 使用手术刀去除孔洞边缘残留的PDMS。使用无毒硅胶粘合剂将PDMS装置及其盖子固定在盖玻片（75 mm × 50 mm 显微载片）上，并静置过夜使其固化（将胶水涂在装置的光滑面）。
   7. 插入十二根22 G针头用于管腔，十二根18 G针头用于孔腔。使用硅胶固定所有针头并静置过夜。在盖子上插入两根18 G针头，以确保肠道类器官培养装置内有适当的空气流通。
   8. 使用装水的注射器检查所有针头是否泄漏。通过向孔腔中注水检查是否存在渗漏。
   9. 在每根将连接结肠的22 G针头上打两个外科结。将装置和盖子放入高压灭菌纸袋中，并进行高压灭菌。
2. 培养基配制（0.5小时）
   1. 在生物安全柜中，将以下成分混合于50 mL离心管中：37 mL Iscove改良Dulbecco培养基（IMDM）、10 mL KSR血清替代物、1 mL B27添加剂、0.5 mL N2添加剂、0.5 mL 1 M HEPES缓冲液和0.5 mL非必需氨基酸。
   2. 过滤后，将完全培养基储存在4 °C环境中。
3. 导管与手术器械准备
   1. 根据需要裁剪适当长度的导管，用于管腔输入、孔腔输入、管腔输出和孔腔输出（共12根短管和12根长管）。在每根导管两端连接合适的接头。
   2. 准备手术器械：直剪刀、4把细镊子和2把尖头镊子。
   3. 将导管和手术器械放入高压灭菌纸袋中，并进行高压灭菌。
4. 准备管腔输入物（所需刺激物——细菌、粪便、药物等）。
   1. 实验前通过梯度稀释法测定细菌培养物的菌量，并在有氧和/或无氧条件下培养。
   2. 计算出菌量后，用无菌组织培养基稀释细菌培养物，以获得所需的细菌浓度。对于粪便样本，使用100 μm滤网过滤。
      注意：对于非细菌性刺激物（如药物、代谢物等），使用肠道类器官培养基将物质稀释至所需浓度。

2. 实验设置准备

1. 在器官培养孵育箱内，打开加热装置，并将其设定为 37 °C。
2. 安装泵系统以及输入和输出注射器。
3. 组织培养基输入
   1. 在生物安全柜或层流罩内，用完全培养基填充输入孔板注射器。最终体积取决于实验持续时间和流速；通常为每小时 1 mL，另加用于冲洗的额外培养基。
   2. 使用鲁尔锁接头将管路连接至注射器。将装满的注射器放入注射泵中。
   3. 冲洗输入注射器。确保孔板培养基从所有管路流出并进入废液杯中。
4. 管腔输入
   1. 用刺激处理液（细菌、药物等）填充管腔输入注射器。体积取决于实验持续时间和流速（通常为每小时 30 µL，另加用于冲洗的额外培养基）。
   2. 使用鲁尔锁接头将管路连接至注射器。将装满的注射器放入注射泵中。
   3. 冲洗输入注射器。确保刺激物流出所有管路并进入废液杯中。注意避免不同刺激物之间的交叉污染。
5. 输出
   1. 将空注射器放入输出注射泵中（将泵模式设为“抽取”）。
6. 装置设置
   1. 调节控制气体混合物（95% O₂ + 5% CO₂）流速的调节器，使其保持轻柔、最低限度的气流。
   2. 在层流罩内检查装置。
   3. 用无菌 IMDM 冲洗装置的针头，以清洗针头。
   4. 向装置的每个孔中加入 500 µL 无菌培养基。
7. 组织解剖前准备
   1. 将无菌手术器械放入层流罩内。
   2. 用无菌 IMDM 填充一支 10 mL 注射器，并连接一根无菌（经高压灭菌）的 22 G 钝端针头，用于冲洗结肠。

3. 器官培养

1. 小鼠处死与组织解剖
   1. 在超净工作台中，通过断头法处死 12 至 14 日龄的小鼠。用 70% 乙醇喷洒小鼠，并将其放置在塑料板上。
   2. 使用锋利的剪刀和镊子，剪除所有脂肪和结缔组织，将小鼠解剖并取出从胃到肛门的消化道。剪下结肠并将其放置在新的培养皿中。
      注意：尽量减少与结肠组织的接触。不要触碰结肠组织的中段部分。仅在组织边缘轻柔操作，避免直接抓握。
2. 结肠冲洗与清洗
   1. 在解剖显微镜下，使用已准备好的 10 mL 注射器（步骤 2.7.2）通过近端向内注入无菌 IMDM，轻柔冲洗结肠内容物。在清除肠道组织中的粪便后，将结肠置于含有 0.5 mL 无菌 IMDM 的新 6 孔板中。
3. 将结肠连接至装置
   1. 取组织，小心地将其连接至 22 G 针头，并用两根缝线紧密固定。此时必须确保结肠的方向正确，以匹配管腔流动方向（近端 = 输入，远端 = 输出）。对全部 6 个组织重复步骤 3.2–3.3。
   2. 检查输入针头的鲁尔接口是否无培养基残留。如有，需排空。向输入针头的鲁尔接口中加入刺激液（以避免气泡进入管腔）。对每个结肠根据相应的刺激条件重复此步骤。
   3. 确认所有组织均已连接，并将盖子盖在装置上方。
4. 将器官培养装置连接至泵
   1. 将装置放入预热的温控培养室（37 °C）中。
5. 连接气体流
   1. 使用合适的输入针头将气体适配器连接至盖子。
   2. 将输入和输出管路连接至装置。
      注意：将结肠近端侧连接至输入管路。
6. 用刺激液冲洗管腔
   1. 通过肠道轻柔灌注管腔刺激液，并确认输出管路中有培养基流动。
   2. 清洗外部培养基。
   3. 清洗外部培养基 3 次（将泵设为输入和输出孔均为 600 µL/min 的流速）。每次清洗持续 1 分钟（从排空孔开始）。
7. 开始实验
   1. 以以下流速启动泵：
      流速：管腔：输入 - 30 µL/h，输出 - 35 µL/h
      外部培养基：输入 - 1000 µL/h，输出 - 950 µL/h
      注意：实验时间可在 30 分钟至 24 小时之间变化。
8. 实验结束（结肠类器官培养最长可达 24 小时）
   1. 断开装置上的所有管路。
   2. 将组织从针头上取下，并继续进行所需的检测分析。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
设备
18号钝针	Mcmaster	75165a754
22号钝针	Mcmaster	75165a758
通用型100%硅胶密封胶	DAP	688
立方体真空干燥器 VDC-21+ 2层搁板		AAAD4021
1 mm厚玻璃载片	Corning	2947-75X50
迷你培养箱 im-10		AAH24315K
MPC 301E 真空泵		VI-412711
塑料快接式管塞	Mcmaster	51525k121
塑料快接式管接头	Mcmaster	52525k211
Sylgard 184 硅橡胶弹性体	Dow		聚二甲基硅氧烷，PDMS
导管	Mcmaster	6516t11
Zortrax M200	Zortrax		Zortrax Z-SUITE，Autodesk Fusion 360
Zortrax M200 材料：z-ultrat	Zortrax
培养基
B27添加剂（50倍浓度），无血清	Thermo Fisher Scientific	17504044
含酚红的Iscove改良型DMEM培养基（1倍浓度）	Thermo Fisher Scientific	12440061
HEPES缓冲液（1 M）	Thermo Fisher Scientific	15630056
Knock-Out 血清	Thermo Fisher Scientific	10828028
N2添加剂（100倍浓度）	Thermo Fisher Scientific	A1370701
非必需氨基酸（100倍浓度）	Thermo Fisher Scientific	11140035
手术器械
大剪刀	Aseltech	11-00-10
尖头镊子	F.S.T	11297-10
编织丝线手术缝合线	SMI	8010G
直剪刀	F.S.T	14091-09
细镊子	F.S.T	11051-10
器官系统
0.1 µm 滤器	Life Gene
0.22 µm 滤器	Life Gene
5 mL 鲁尔锁注射器	B-D	309649
Greenough体视显微镜	ZEISS	Stemi 305
循环式精密空气加热器 "CUBE"		CUBE-2-LIS
注射泵	New Era Pump Systems Inc	nep-ne-1600-em