通过细胞内染色与流式细胞术分析烟草制品制剂对细胞因子产生的影响

摘要

来源：Arimilli, S. 等，可燃烟草产品制剂细胞毒性与免疫抑制作用的评估方法 J. Vis. Exp. (2015)

本视频展示了烟草制品制剂（TPPs）对人外周血单个核细胞细胞因子产生的影响，检测方法为流式细胞术。经TPP处理的细胞在脂多糖刺激后，再进行免疫染色和流式细胞术分析，结果显示其促炎性细胞因子的产生受到抑制。

方案

所有涉及人类参与者的操作均按照机构、国家和国际关于人类福祉的指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审查。

1. WS-CM 的制备

1. 按先前所述方法制备全烟气条件培养基（WS-CM）。
   1. 采用以下吸烟程序，将四支3R4F标准香烟产生的烟雾通入不含酚红的RPMI 1640培养基中，以制备WS-CM：每次抽吸体积为35 ml，抽吸间隔为60秒，抽吸持续时间为2秒。每次制备可获得20 ml样品。
2. 在管子上标注日期、完成时间以及香烟名称和编号。吸烟完成后立即于-80 °C保存500 µl分装样品。
3. 分析冷冻保存的WS-CM分装样品，以测定尼古丁、烟草特异性亚硝胺和多环芳烃的含量，方法同前文所述。

2. 外周血单个核细胞（PBMC）的分离

1. 从健康献血者（不使用烟草制品）采集新鲜血液，按以下方法分离外周血单个核细胞（PBMCs）。
   1. 在血袋送达前，准备好一个500 ml的瓶子、剪刀、分离缓冲液和室温的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS），置于生物安全二级（BSL-2）细胞培养操作台中。分离缓冲液必须避光保存。
   2. 将血袋倒置，用剪刀在夹闭处下方剪断导管，保留至少3 cm的管段。
   3. 取下500 ml瓶的瓶盖，将导管置于瓶口上方。拿起血袋并倒转，使血液自由流入瓶中直至排空。让血液沿瓶内壁流下，避免直接垂直滴落，以减少气泡产生。
   4. 按1:5的体积比将分离缓冲液加入瓶中（分离缓冲液体积:血液体积）。盖紧瓶盖，轻轻翻转瓶子10次，使混合均匀。将瓶子置于细胞培养操作台中，关闭光源，室温孵育1小时。
   5. 血液上方将形成一层浅黄色、类似稻草色的液体层。用25 ml移液管将该层转移至50 ml离心管中。收集量可能因献血者个体差异而介于50–300 ml之间。
   6. 在室温下以200 × g 离心10分钟。
   7. 吸除透明的上清液，保留底部深色血液样沉淀。沉淀质地松散但具黏性。
   8. 向15 ml离心管中加入3 ml分离缓冲液。
   9. 向重悬的沉淀中，每收集50 ml步骤2.1.5所得的稻草色液体，加入20 ml DPBS。充分涡旋混匀，并将多个离心管中的重悬液合并。此液体含有悬浮的血细胞。
   10. 用移液器将5 ml悬浮血细胞缓慢加至步骤2.1.8中含3 ml分离缓冲液的15 ml离心管上。缓慢、轻柔地倾斜含有细胞悬液的15 ml离心管，形成两层分离的液体。在室温下以400 × g 离心40分钟，加速度最小，不使用刹车。
   11. 用移液器小心吸取离心后出现的浑浊中间层（即血沉棕黄层，buffy coat），转移至50 ml离心管中，避免吸取其下方的透明层。每管50 ml离心管中转移体积不超过25 ml。
   12. 加入25 ml预冷的运行缓冲液（或更多，以填满50 ml离心管剩余体积）洗涤细胞。在4 °C下以400 × g 离心10分钟。
   13. 用10 ml运行缓冲液重悬沉淀，即得PBMCs。计数细胞，并立即使用或置于冰上准备冻存。

3. PBMC 的冻存与复苏

1. 将步骤 2.1.13 中收集的外周血单个核细胞（PBMCs）在 400 × g 条件下离心 10 分钟。
2. 根据制造商说明，用异丙醇填充冷冻容器。
   注意：异丙醇易燃，且具有急性毒性。
3. 用含 20% 胎牛血清（FBS）和 10% 二甲基亚砜（DMSO）的 RPMI 1640 培养基（4 °C）重悬细胞沉淀。此即 RPMI 1640 冻存培养基。加入适量冻存液，使细胞终浓度约为 5 × 10⁷ 个细胞/ml。可用于冻存的细胞数量因样本而异。
4. 将 1 ml 细胞悬液分装至 2 ml 冻存管中，放入冷冻容器。将装有冻存管的冷冻容器置于 -80 °C 冰箱中过夜（O/N）保存，随后取出冻存管，转移至 -150 °C 至 -190 °C 的超低温冰箱中长期保存。
5. 从超低温保存环境中取出冻存管，在 37 °C 水浴中轻轻振荡快速解冻。
6. 立即将解冻后的冻存管内 PBMCs 转移至含 10 ml 完全 RPMI 1640 培养基（4 °C，含 10% FBS、1% 青霉素/链霉素和 1% L-谷氨酰胺）的 15 ml 圆底离心管中。为获得最大细胞活力，应尽快完成解冻后细胞的转移。
7. 在 400 × g 条件下离心 PBMCs 10 分钟。
8. 用 5 ml RPMI 1640 完全培养基重悬细胞沉淀，并进行细胞计数。
9. 采用台盼蓝排斥法等标准方法测定细胞活力。通常情况下，该方法所得细胞活力约为 90–95%。此时 PBMCs 已可用于后续实验。

4. 胞内染色与流式细胞术

注意：此处列出的稀释比例仅适用于本研究，可根据实际情况进行相应调整。

1. 在96孔板中，使用完全RPMI培养基将WS-CM稀释至每孔总体积为100 µl，其等效尼古丁单位浓度分别为0.3、1.56、3和5 µg/ml。
2. 在同一块板中，将尼古丁稀释至以下浓度：2、10、50、100、500、2000和4000 µg/ml。
   注意：尼古丁具有急性毒性，且对环境有害。
3. 向每孔加入100 µl以完全RPMI培养基悬浮的PBMCs，细胞浓度为1 × 10⁶ 个细胞/孔。细胞与WS-CM或尼古丁的总体积为200 µl/孔。
4. 盖好板，于37 °C、5% CO₂条件下孵育3小时。
5. 在室温下，以300 × g离心3分钟洗涤细胞，吸除上清液，在盖好板盖的情况下涡旋震荡板底，然后用200 µl预冷的运行缓冲液重悬细胞，并重复洗涤一次。
6. 向板中每孔加入200 µl完全RPMI培养基，再重复洗涤一次。
7. 使用完全RPMI培养基配制工作浓度为2 µl/ml的GolgiPlug和10 µg/ml的LPS，并向每孔加入200 µl。
8. 将板于37 °C、5% CO₂条件下孵育6小时。
9. 步骤9.8结束后，用运行缓冲液（4 °C）洗涤细胞，并在4 °C下以300 × g离心3分钟。
10. 向每孔加入100 µl Cytofix，于4 °C孵育20分钟。
11. 按照步骤9.9所述方法，使用1× Permwash（4 °C）在4 °C下以300 × g离心3分钟，重复洗涤3次。
12. 向每孔加入45 µl 1× Cytoperm，随后向每孔分别加入以下抗体之一各5 µl：TNF-α-Alexa Fluor 488、IFN-γ V500、MIP-1α PE。于4 °C孵育30分钟。
13. 按照步骤9.9所述方法，使用1× Permwash（4 °C）洗涤两次，并用运行缓冲液（4 °C）洗涤一次，每次均在4 °C下以300 × g离心3分钟。
14. 用200 µl 2%多聚甲醛（4 °C）重悬细胞。将细胞转移至12 × 75 mm试管中，在流式细胞仪上分析样品。
    注意：多聚甲醛具有腐蚀性，属急性毒性物质，且对健康有害。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
12 × 75 离心管	BD Falcon	352058
15 ml 锥形离心管	Corning	430790
2 mL 微量离心管	Axygen	MCT-150-C-S
3R4F 参考香烟	肯塔基大学农业学院	3R4F
50 ml 锥形离心管	Corning	430828
500 ml 瓶	Corning	430282
96 孔平底培养板	Thermo Nunc	439454
细胞培养超净台	Thermo Scientific	1300 系列 A2
离心机	Eppendorf	58110R
Cytofix/Cytoperm（Permwash）	BD Biosciences	555028	易燃
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
滤器装置	Nalgene	156-4020
流式细胞仪	BD Biosciences	FACS Canto II	8 色，激发波长 405，发射波长 785。
流式细胞仪	BD Biosciences	FACS Calibur	4 色，激发波长 495，发射波长 785。
流式细胞术分析软件	Tree Star	FlowJo
冻存容器	Nalgene	5100-0001	含 DMSO ，具刺激性
GogliPlug	BD Biosciences	555029	致癌物、刺激物、腐蚀物
IFN-γ V-500 抗体	BD Horizon	561980	皮肤致敏物
分离缓冲液	Isolymph, CTL Scientific Corp.	1114868	易燃液体，具刺激性
异丙醇	Sigma-Aldrich	W292907
L-谷氨酰胺	Gibco Life Technologies	25030-081
LPS	Sigma-Aldrich	L2630
MIP1-α PE 抗体	BD Pharmingen	554730	急性毒性，经口
尼古丁	Sigma-Aldrich	N3876	急性毒性，环境危害
Parafilm	Bemis	"M"
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	P6148	易燃，皮肤刺激
青霉素/链霉素	Gibco Life Technologies	15140-122
RPMI 1640	Gibco Life Technologies	11875-093
运行缓冲液	MACS Running Buffer, Miltenyi Biotech	130-091-221
TNF-α Alexa Fluor 488 抗体	BioLegend	502915
移液管	Fisher Scientific	13-711-20