金黄色葡萄球菌体外生物膜合成

1. 体外生物膜的制备

1. 在营养丰富的琼脂平板上使用条纹板技术从冻存的原液中获得分离的金黄色葡萄球菌菌落，例如胰蛋白酶大豆琼脂（参见材料表）。
2. 用 100 μL 在无菌 H₂O 中稀释的 0.001% （v/v） 聚-L-赖氨酸 （PLL） 包被 96 孔板的单个孔，并在室温下孵育 30 分钟。在无菌条件下，使用真空辅助吸液阱吸出 PLL 溶液。让孔在室温下干燥过夜。
   注意:除非另有说明，否则方案中的所有吸液步骤均使用真空辅助吸液阱进行。
3. 通过在补充有 2% 葡萄糖的最低必需培养基 α （MEMα） 中接种金黄色葡萄球菌菌落来制备过夜培养物，并在 37 °C 下孵育，以 200 rpm 振荡 16-18 小时。
4. 通过将 50 μL 转移到 5 mL 补充有 2% 葡萄糖的新鲜 MEMα 中来稀释过夜培养物，并在 37 °C 下孵育，以 200 rpm 振荡，直至对数中期，通常在光密度 600 （OD_600nm） 之间为 0.5-0.8。使用 MEMα 将中对数培养物标准化为 OD_600nm 为 0.1。
5. 将 150 μL 标准化培养物转移到 PLL 处理的 96 孔板的每个孔中。在 37 °C 的加湿室中静态孵育 18-20 小时><。 注意: 生物膜也可以以其他形式生长，例如 μ 通道载玻片（参见材料表）。
6. 吸出上清液以去除浮游细胞。用 150 μL Hanks 平衡盐溶液 （HBSS） 轻轻洗涤剩余的生物质，以去除未附着的细胞。逐滴添加 HBSS 以避免破坏生物膜。
   注意: 在洗涤过程中吸出上清液和 HBSS 的同时，在含有生物膜的孔中留下足够的液体（上清液或 HBSS），以便生物膜仍处于浸没状态。这可以防止在滴加 HBSS 以清洗生物膜时破坏生物膜结构。
7. 再重复步骤 1.6 至少两次以去除所有浮游细胞。此时，生物膜已准备好立即进行下游实验。
   注意:如果生物膜不用于中性粒细胞实验，则可以用磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 代替 HBSS。HBSS 优于 PBS，因为 HBSS 含有包括葡萄糖在内的成分，为中性粒细胞活化提供了最佳条件。