体外生物膜合成 金黄色葡萄球菌

摘要

来源：Rana, P. S. 等., 标准化体外实验以观察和定量人中性粒细胞与 Staphylococcus aureus 生物膜 视频实验杂志 (2022)

在本视频中，我们演示了金黄色葡萄球菌（S. aureus）在聚-L-赖氨酸包被的多孔板中体外生物膜的制备过程。所形成的生物膜板可用于后续实验。

方案

1. 准备 体外 生物膜

1. 获得单个菌落 S. aureus 使用划线平板技术，在富含营养的琼脂平板（如胰蛋白胨大豆琼脂，Tryptic Soy Agar）上，从冻存菌种中复苏菌株（参见 材料表).
2. 在96孔板的每个孔中加入100 µL用无菌H₂O稀释的0.001%（v/v）聚-L-赖氨酸（PLL）进行包被₂O，并在室温下孵育30分钟。在无菌条件下，使用真空辅助吸液装置吸除PLL溶液。让孔板在室温下过夜干燥。
   注意： 除非另有说明，方案中的所有抽吸步骤均使用真空辅助抽吸装置进行。
3. 通过接种一环菌落来制备过夜培养物 S. aureus 在添加2%葡萄糖的最低必需培养基α（MEMα）中，37 °C、200 rpm振荡培养16–18小时。
4. 将过夜培养物取50 µL转移至5 mL含2%葡萄糖的新鲜MEMα培养基中稀释，于37 °C、200 rpm振荡培养至对数中期，通常光密度600（OD_{600 nm}0.5–0.8 的 OD 值。使用 MEMα 将对数中期培养物调至标准化的 OD_{600 nm} 0.1 的
5. 将150 µL标准化培养物转移至PLL处理的96孔板的每个孔中。在37 °C的湿润培养箱中静置培养18–20小时。
   注意： 生物膜也可在其他装置中培养，例如 µ-通道载玻片（参见 材料表).
6. 吸除上清液以去除浮游细胞。用150 µL汉克斯平衡盐溶液（HBSS）轻轻冲洗残留的生物膜，以去除未贴壁的细胞。滴加HBSS时应缓慢，避免破坏生物膜。
   注意： 洗涤过程中吸取上清液和HBSS时，应在含有生物膜的孔中保留足够液体（上清液或HBSS），使生物膜仍处于浸没状态。这可防止滴加HBSS洗涤生物膜时破坏其结构。
7. 重复步骤1.6至少两次，以彻底去除所有浮游细胞。此时，生物膜已准备好进行后续实验。
   注意： 如果生物膜不用于中性粒细胞实验，可用磷酸盐缓冲液（PBS）替代HBSS。但首选HBSS而非PBS，因为HBSS含有葡萄糖等成分，可为中性粒细胞活化提供最佳条件。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BD Bacto 胰蛋白胨大豆肉汤	BD	DF0370-07-5	与 1.5% 琼脂混合制备胰蛋白胨大豆琼脂
透明底 96 孔平底聚苯乙烯板	Costar	3370
Hanks' 平衡盐溶液 (HBSS) 1x	Corning cellgro	21-022-CV	不含钙、镁和酚红
聚-L-赖氨酸溶液	Sigma	P4707-50ML
白色不透明 96 孔板	Falcon	353296	经组织培养处理的平底板
最低必需培养基 (MEM) Alpha 1x	Gibco	41061-029