一种通过致病菌体外刺激淋巴细胞的技术

摘要

来源：Dousha, L., 等 评估呼吸道免疫应答 流感嗜血杆菌. 视觉实验杂志. (2021)

本视频演示了一种 体外 刺激淋巴细胞的技术 通过 非可分型 流感嗜血杆菌 （NTHi）并评估免疫反应。将分离的外周血单个核细胞（PBMCs）与NTHi共孵育，可使细菌细胞刺激T淋巴细胞，从而诱导细胞因子的产生。通过抑制细胞因子的分泌后，进行免疫荧光染色以检测受刺激T淋巴细胞内积聚的细胞内细胞因子。

方案

1. 抗原制备

注意： 可使用三种不同的抗原制剂来评估对 Hi 的免疫应答。这些制剂分别为：1）亚细胞组分（通常来自细菌细胞壁）；2）灭活的细菌；3）活细菌。在开始任何实验之前，需确定每种抗原制剂的用途。

1. 亚细胞组分
   1. 从各种来源获取亚细胞组分，包括商业制备物、实验室自制品，以及来自其他研究人员的样品。
      注意：通常来源于细菌细胞壁的亚细胞组分可被使用，包括外膜蛋白（如P6）和脂寡糖（LOS）。这些亚细胞组分通常由专业中心制备，其具体制备方法不在本文讨论范围之内。建议直接联系该领域的专家以获取这些组分。
2. 灭活/失活细菌
   1. 从合适的样本（例如痰液或支气管镜样本）中获取细菌。通过适当的微生物学实验室确认菌株为H. influenzae。由专业的微生物学实验室对H. influenzae样本进行分型，确认其为无荚膜型（NTHi）。
   2. 为获得具有代表性的抗原，使用多种NTHi菌株（至少5种，每种数量大致相等）制备混合抗原。将菌株保存于含甘油的培养液中，置于-70 °C条件下，存放在微量离心管中。
      注意：本实验中使用了十个不同的菌株。
   3. 将菌株（每次一个微量离心管）在巧克力琼脂平板上解冻，并在37 °C、含5% CO₂的培养箱中过夜培养。将细菌加入500 μL磷酸盐缓冲液（PBS）中，洗涤两次（300 x g离心5分钟）。使用麦氏比浊标准或分光光度计将NTHi分装至浓度为10⁸ mL（使用5 mL容器或等效容器）。
   4. 将细菌置于56 °C水浴中加热10分钟，以实现热灭活。
   5. 使用低至中等功率的连续超声模式对细菌进行30秒超声处理。
   6. 将适量体积的样品分装至微量离心管中。对于10⁸ mL的样品，使用50 μL的分装量（即每毫升可分装20份），并在需要时保存于-70 °C冷冻。
3. 活细菌
   1. 首先，按照步骤1.2.1所述方法对活细菌进行表征。使用一个特征明确的菌株，并确保该菌株也以甘油培养液形式保存于-70 °C作为储备。
   2. 在富集培养基（如巧克力琼脂平板或液体培养基）中培养细菌。
      1. 若使用巧克力琼脂平板，需使用无菌涂布器每隔3-4天至少传代一次。
      2. 或者，使用添加了X因子（血红素）和V因子（β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）的脑心浸出液（BHI）培养基培养细菌。从过夜培养的平板中接种NTHi至5-10 mL含有血红素和β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（均为10 µg/mL）的BHI培养基中，在37 °C、5% CO₂培养箱中过夜培养。
         注意：该方法具有可重复性好、菌落形成单位（CFU）数量高、所有细菌均处于相似的对数生长期的优点（而在平板上，细菌的活力可能因培养位置不同而有所差异）。
   3. 使用感染复数（MOI）为100（即每个细胞感染100个细菌）以诱导强烈的免疫反应，同时维持细胞活力。使用麦氏比浊标准或分光光度计评估细菌数量。
   4. 确保用于活NTHi检测的培养基中不含任何人血清，因为人血清会杀死细菌。动物血清样本（如胎牛血清）通常不会引起问题。
      注意：使用下述方法分析标准组织样本，如外周血、支气管镜样本（特别是支气管肺泡灌洗液（BAL））以及切除的肺组织。将样本与Hi抗原孵育10分钟至24小时或更长时间。

2. 外周血淋巴细胞功能的评估

1. 使用全血或单个核细胞制备物进行流式细胞术检测。
2. 通过静脉穿刺采集每位受试者的样本。从外周静脉采集4 mL血液至含锂肝素的采血管中，并将样本分装为对照组和抗原刺激组。
3. 向两份样本中均加入共刺激抗体（抗-CD28 和 CD49d，1 µL/mL）。向抗原组样本中加入NTHi，并在37 °C、5% CO₂条件下孵育1小时。对于灭活NTHi制剂，将200 μL抗原加入2 mL血液中；对于活NTHi，则按MOI为100:1的比例将活NTHi细胞加入白细胞中（通过血细胞计数板测定）。
4. 向样本中加入高尔基体阻断剂布雷菲德林A（Brefeldin A，10 µL/mL），并继续孵育5小时。
   注意：阻断高尔基体可防止细胞因子被转运至细胞外。
5. 若使用全血，需用0.8%氯化铵裂解红细胞，仅保留白细胞于溶液中。使用500 μL的1%-2%多聚甲醛固定白细胞，孵育1小时。
6. 通过血细胞计数板计数细胞，用100 μL含0.1%皂苷的溶液对10⁶个细胞进行透膜处理，持续15分钟，随后与荧光标记抗体孵育。洗涤细胞后，使用流式细胞仪进行分析。
   注意：荧光标记抗体的用量因不同细胞因子而异，请参照生产商说明书。通常情况下，10⁶个细胞溶于100 μL溶液中，染色时间为1小时。大多数商业来源的抗体足以进行25-100次检测。
7. 通过设门分析相关淋巴细胞群（细胞依次根据CD45、CD3，再根据CD4或CD8表达进行设门）来确定抗原应答细胞的比例，如图1所示。对所有待分析的细胞因子，均需对未刺激细胞进行背景染色。每种细胞因子均需分析刺激组和对照组，每组筛查100,000个细胞。

结果

图1：肺组织中的细胞因子产生。 首先通过流式细胞术分析细胞表达白细胞标志物 CD45（A）。随后对该细胞群进一步分析其 CD3 表达（B）以及 CD4/CD8 表达（C）。在对照（D）和 NTHi 刺激样本（E）中评估 CD3/CD4+ 细胞的胞内细胞因子产生情况。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯化铵	Sigma Aldrich	213330
Brefeldin	Sigma Aldrich	B6542
CD28	Thermofisher	16-0289-81
CD49d	Thermofisher	534048
皂苷	Sigma Aldrich	8047152