感染的人体组织来源细胞中炎症介质的定量

Abstract

来源:Dousha， L. et al.， 评估对流感嗜血杆菌的呼吸免疫反应。J. Vis. Exp.（2021 年）

该视频演示了通过将人肺组织来源的免疫细胞与流感嗜血杆菌一起孵育来定量感染过程中的炎症介质。流式细胞术用于测量标记淋巴细胞中的细胞因子荧光，与细菌感染后促炎细胞因子的产生相关。

Protocol

所有涉及人类参与者的程序均已按照机构、国家和国际人类福利指南执行，并已由当地机构审查委员会审查。

1. 抗原制剂

1. 活细菌
   1. 首先，表征活细菌。从适当的样本（例如痰液或支气管镜检查）中获取细菌。使用适当的微生物学实验室确认菌株为流感嗜血杆菌。对流感嗜血杆菌样本进行分型，以确认它们是不可分型的（由专业微生物学实验室）。使用一种特征明确的菌株。确保菌株也储存在-70°C的甘油汤中作为储备。
   2. 在巧克力琼脂板或肉汤等富集培养基上培养细菌。
      1. 要使用巧克力琼脂板，请至少每 3-4 天使用无菌撒布器传播细菌。
      2. 或者，使用富含因子 X（血红素）和 V（β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）的脑心输液 （BHI） 肉汤来培养细菌。将不可分型的流感嗜血杆菌 （NTHi） 从过夜板中接种在 5-10 mL 补充有血红素和 β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（均为 10 μg/mL）的 BHI 肉汤中，并在 37 °C 下在 5% 二氧化碳、CO₂ 培养箱中培养过夜。
         注意:这具有可重复性、更高的菌落形成单位 （CFU） 计数以及所有细菌都处于相似的对数生长阶段（在平板上，细菌活力可能更高，具体取决于培养物中的位置）。
   3. 在一个细胞中使用 100 个细菌的感染复数 （MOI） 来引发强烈的免疫反应，同时保持细胞活力。使用 MacFarland 标准品或分光光度计评估细菌数量。
   4. 确保用于活 NTHi 检测的培养基不含任何人血清，因为这会杀死细菌。动物血清样本（例如胎牛血清）通常不会引起任何问题。
      注:使用下述方法分析标准组织样本，例如外周血、支气管镜样本（特别是支气管肺泡灌洗液 （BAL））和切除的肺组织。将样品与 Hi 抗原孵育 10 分钟至 24 小时或更长时间。

2. 肺组织中淋巴细胞功能/炎症介质的评估

1. 通常不可能从支气管镜检查中获得足够的淋巴细胞;因此，使用肺叶切除术样本中的肺组织。肺组织样本的优化需要与解剖病理学服务部门密切联系。确保组织距离肿瘤至少 3 厘米的边缘，并且是没有明显肺气肿的细胞组织（由病理学家确定）。
2. 在用于流式细胞术测定之前，将肺组织分解成细胞悬液。化学消化肺组织（例如，用胶原酶）或机械解聚肺组织。
   注意:组织的机械解聚可能是首选，因为这与更好的细胞表面染色（例如，CD3/4 标记）有关。
   1. 从病理学家处获取肺叶切除术样本（通常从接受肺癌治疗的患者那里获得）。将约 20-40 g 样品切成 3-5 mm³ 段。将它们放入无菌的 50 μL 腔室中，然后使用适当的解聚器进行机械碎裂。
   2. 组织解聚后，用 10:1（即 5 mL）的 0.8% 氯化铵（150 mM 氯化铵 （NH₄Cl）、1 mM 碳酸氢钠 （NaHCO₃） 和 0.1 mM 乙二胺四乙酸 （EDTA） 溶液裂解红细胞。
      注意:或者，也可以使用 Q-prep 等自动化系统。
   将
   3. 细胞重悬于无菌 RPMI 中（体积取决于细胞数量，通常为 10-20 mL），然后通过 100 μm 无菌尼龙网过滤。使用台盼蓝排除法计数活细胞的数量。

3. NTHi 感染检测

1. 将肺细胞重悬至每管 4 x 10⁶ 个细胞/mL 的最终细胞浓度（对照和刺激样品）。
2. 对于（阴性）对照管，使用 4 x 10^6-6 x 10⁶ 个细胞的悬浮液，溶于 1 mL RPMI 中。对 NTHi 管使用相同量（任何其他样品可用作葡萄球菌超抗原 E （SEB） 的阳性对照）。以每个细胞 100 个细菌的 MOI 感染 NTHi 管中的细胞。将盖子松开半圈，以允许气体在管中转移。
3. 将细胞放入试管旋转器中，并在 37 °C 下孵育，同时以 12 rpm 旋转。
4. 为防止细胞因子的细胞外输出，在刺激后 1 小时向细胞悬液中加入高尔基体阻滞剂 （Brefeldin A），最终浓度为 10 μg/mL。将细胞悬液放回旋转孵育 16-22 小时。
5. 用 500 μL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 洗涤细胞悬液，其中含有 1% 牛血清白蛋白 （BSA） 和 0.01% 叠氮化钠 NaN₃。
6. 添加抗体进行细胞内细胞因子染色（抗体的选择由研究者决定）。对细胞悬液进行特异性人淋巴细胞表面标志物（例如，CD45、CD3 等）染色 1 小时。用 PBS 洗涤细胞，固定并透化它们。
7. 使用 500 μL 1%-2% 多聚甲醛固定细胞 1 小时。
8. 通过血细胞计数器计数细胞，用 100 μL 0.1% 皂苷透化 10⁶ 个细胞 15 分钟，并与荧光标记抗体孵育细胞。洗涤细胞并使用流式细胞仪进行分析。
   注意:荧光标记抗体的数量对每种细胞因子具有特异性。按照制造商的说明进行作。通常，100 μL 溶液中的 10^{个 6} 个细胞将染色 1 小时。大多数市售抗体足以进行 25-100 次测试。
9. 将细胞与细胞内细胞因子染色抗体（例如干扰素-γ、IFN-γ和肿瘤坏死因子 β、TNF-α 或白细胞介素、IL-13 和 IL-17A）孵育 1 小时
   注意:建议先对表面标志物进行染色，然后在细胞内染色，因为固定会导致抗体结合的表面蛋白发生构象变化。
10. 用 500 μL PBS 洗涤细胞，并在 100 μL PBS 中重悬，然后在流式细胞仪上采集数据。

Materials