感染人源组织细胞中炎症介质的定量分析

来源：Dousha, L. 等人， 评估呼吸道免疫应答 流感嗜血杆菌. J. Vis. Exp. (2021)

本视频展示了通过将人肺组织来源的免疫细胞与流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）共孵育，以量化感染过程中炎症介质的方法。采用流式细胞术检测标记淋巴细胞中的细胞因子荧光信号，从而反映细菌感染后促炎性细胞因子的产生情况。

所有涉及人类受试者的研究程序均按照机构、国家及国际人类福利指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审核。

1. 抗原制备

活细菌
1. 首先，对活细菌进行表征。从适当的样本（如痰液或支气管镜样本）中获取细菌。通过适当的微生物学实验室确认菌株为 Haemophilus influenzae 。对 H. influenzae 样本进行分型，以确认其为无荚膜型（由专业微生物学实验室完成）。使用一个特征明确的菌株，并确保该菌株也保存在-70 °C的甘油肉汤中作为储备。
2. 在富含营养的培养基（如巧克力琼脂平板或液体培养基）中培养细菌。
  1. 若使用巧克力琼脂平板，需用无菌涂布棒每隔至少3–4天对细菌进行一次涂布传代。
  2. 或者，使用添加了X因子（血红素）和V因子（β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）的脑心浸液（BHI）肉汤培养细菌。从过夜培养的平板中接种非荚膜型 H. influenzae（NTHi）至5–10 mL BHI肉汤中，该肉汤需补充血红素和β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（均为10 µg/mL），并在37 °C、5%二氧化碳（CO₂ ）培养箱中过夜培养。
    注意：此方法具有可重复性好、菌落形成单位（CFU）数量高以及所有细菌处于相似对数生长期的优点（而在平板上，细菌的活力可能因培养位置不同而有所差异）。
3. 使用感染复数（MOI）为100的细菌与一个细胞作用，以在维持细胞活力的同时引发强烈的免疫反应。使用麦氏比浊标准或分光光度计来评估细菌数量。
4. 确保用于活NTHi检测的培养基中不含任何人血清，因为人血清会杀死细菌。动物血清样本（如胎牛血清）通常不会引起问题。
  注意：使用下述方法分析标准组织样本，如外周血、支气管镜样本（特别是支气管肺泡灌洗液（BAL））以及切除的肺组织。将样本与Hi抗原孵育10分钟至24小时或更长时间。

2. 肺组织中淋巴细胞功能/炎症介质的评估

通常无法通过支气管镜检查获得足够的淋巴细胞；因此，请使用肺叶切除样本中的肺组织。优化肺组织样本需要与解剖病理学服务部门密切协作。确保组织距离肿瘤边缘至少3 cm，并且为细胞丰富的组织，无明显肺气肿（由病理学家确定）。
在将肺组织用于流式细胞术检测之前，需将其破碎成单细胞悬液。可通过化学方法（例如使用胶原酶）消化肺组织，或通过机械方法进行解离。
注意：可能更倾向于采用机械解离方法，因为该方法有助于细胞表面标记（如CD3/4标记）获得更好的染色效果。
1. 从病理学家处获取肺叶切除样本（通常来自接受肺癌治疗的患者）。取约20–40 g样本，切成3–5 mm³ 大小的组织块。将其置于无菌的50 µL腔室中，然后使用适当的组织解离仪进行机械破碎。
2. 组织解离后，用10:1比例（即5 mL）的0.8%氯化铵溶液（含150 mM氯化铵（NH₄Cl）、1 mM碳酸氢钠（NaHCO₃）和0.1 mM乙二胺四乙酸（EDTA））裂解红细胞。
  注意：也可使用自动化系统（如Q-prep）替代此步骤。
3. 将细胞重悬于无菌RPMI培养基中（体积取决于细胞数量，通常为10–20 mL），然后通过100 µm无菌尼龙滤网过滤。使用台盼蓝排斥法计数活细胞数量。

3. NTHi 感染实验

将肺细胞重悬，使最终细胞浓度为 4 x 10⁶ 每管细胞数为 cells/mL（对照样本和刺激样本）。
使用 4 × 10 的悬浮液⁶-6 × 10⁶ 1 mL RPMI 培养基中的细胞作为（阴性）对照管。NTHi 管使用相同体积（如有额外样本，可用作阳性对照） 葡萄球菌 超抗原E（SEB）。以每细胞100个细菌的感染复数（MOI）感染NTHi管中的细胞。将管盖松开半圈，以允许管内气体交换。
将细胞置于管式旋转仪中，在37 °C、12 rpm条件下旋转孵育。
为防止细胞因子外排，刺激1小时后向细胞悬液中加入高尔基体阻断剂（布雷菲德林A），使其终浓度为10 µg/mL。将细胞悬液继续在旋转条件下孵育16–22小时。
用含有1%牛血清白蛋白（BSA）和0.01%叠氮化钠（NaN₃）的500 μL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞悬液₃.
加入用于细胞内细胞因子染色的抗体（抗体的选择由研究者自行决定）。将细胞悬液与特异性人淋巴细胞表面标志物抗体（如 CD45、CD3 等）孵育 1 小时。用 PBS 洗涤细胞，固定并透化。
使用500 μL的1%-2%多聚甲醛固定细胞1小时。
使用血细胞计数板对细胞进行计数，透化10⁶ 用100 μL 0.1%皂苷孵育细胞15分钟，然后与荧光标记的抗体共同孵育。洗涤细胞后，使用流式细胞仪进行分析。
注意： 荧光标记抗体的用量因细胞因子的不同而异。请遵循制造商的说明书。通常情况下，10⁶ 100 μL 溶液中的细胞将染色 1 小时。大多数市售抗体足以进行 25–100 次检测。
将细胞与细胞内细胞因子染色抗体（如干扰素-γ、IFN-γ 和肿瘤坏死因子β、TNF-α 或白细胞介素、IL-13 以及 IL-17A）孵育 1 小时。
注意： 建议先染色表面标志物，再进行细胞内染色，因为固定可能导致表面蛋白构象改变，从而影响抗体的结合。
用500 μL PBS洗涤细胞，然后在流式细胞仪检测前重悬于100 μL PBS中。

姓名	公司	目录编号	评论
氯化铵	Sigma Aldrich	213330
布雷菲德菌素	Sigma Aldrich	B6542
Filcon 无菌尼龙筛网	Becton Dickinson	340606
明胶底物，Enzchek	Molecular probes	E12055
MACS 混合管旋转仪	Miltenyi Biotec	130-090-753
Medimachine	Becton Dickinson		目录编号不可用
皂苷	Sigma Aldrich	8047152

感染人源组织细胞中炎症介质的定量分析

本文内容

摘要

方案

材料

标签