中性粒细胞与调理化生物膜相互作用后活性氧产生的测定

摘要

来源：Rana, P. S. J. B. 等 标准化 体外 可视化和定量分析人中性粒细胞相互作用的实验方法 金黄色葡萄球菌 生物膜 视频实验杂志 (2022)

在本视频中，我们演示一种 体外 化学发光法检测中性粒细胞在接触调理化细菌生物膜后活性氧的产生

方案

1. 中性粒细胞产生活性氧的检测

1. 向洗涤后的生物膜中逐滴加入 100 µL 20% 正常人血清（用 HBSS 稀释），在 37 °C 静置条件下孵育 30 分钟，以对生物膜进行调理作用。
2. 吸除 20% 血清溶液，并用 150 µL HBSS 逐滴洗涤生物膜一次。吸除 HBSS，保留含有调理后生物膜的孔。
   注意：为便于实验结果解读，建议至少设置四组：（A）中性粒细胞 + 生物膜，（B）中性粒细胞 + PMA（阳性对照，参见 材料表），（C）仅中性粒细胞，以及（D）仅生物膜。
3. 将鲁米诺（参见 材料表）加入重悬于 HBSS 中的中性粒细胞悬液（细胞浓度为 4 × 10⁶ 个/mL），使鲁米诺终浓度为 50 µM。该溶液可用于（A）和（C）组。取含鲁米诺的 4 × 10⁵ 个中性粒细胞加入含有调理后生物膜的孔中。
4. 另取一离心管，配制不含中性粒细胞的 50 µM 鲁米诺 HBSS 溶液，并将其加入含有生物膜的孔中（D 组）。
5. 取 350 µL 含鲁米诺的中性粒细胞悬液，加入佛波酯-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯（PMA），使 PMA 终浓度为 500 ng/mL。取该混合液中的 4 × 10⁵ 个中性粒细胞加入无生物膜的孔中（....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
50 mL 圆锥形离心管	Thermo Scientific	339652
酒精棉片	BD		用于采血
细胞计数仪	Bal Supply	202C
透明平底 96 孔聚苯乙烯板	Costar	3370
Dulbecco 磷酸盐缓冲液 (DPBS) 1x	Gibco	14190-144
Hanks 平衡盐溶液 (HBSS) 1x	Corning cellgro	21-022-CV	不含钙、镁和酚红
血细胞计数板	Bright Line
鲁米诺	Sigma	A8511-5G
最低必需培养基 (MEM) Alpha 1x	Gibco	41061-029
正常人血清	Complement Technology	NHS
培养皿 (100 × 15 mm)	VWR	25384-342
佛波醇 12-十四烷酸酯 13-乙酸酯
聚-L-赖氨酸溶液	Sigma	P4707-50ML
SoftMax Pro 软件	Molecular Devices		用于数据采集的微孔板读板仪软件
SpectraMax i3x	Molecular Devices		微孔板读板仪