一种用于研究中性粒细胞与生物膜相互作用的体外实验方法

摘要

来源：Rana, P. S. J. B. 等. 标准化 体外 可视化和定量分析人中性粒细胞相互作用的实验方法 Staphylococcus aureus 生物膜 视频实验杂志 (2022)

本视频演示了一种 体外 研究中性粒细胞与生物膜相互作用的检测方法。将嵌入生物膜中的致病菌和分离的中性粒细胞用荧光标记物标记，利用荧光显微镜评估中性粒细胞的免疫反应以及细菌对免疫反应的逃逸。

方案

1. 准备 体外 生物膜

1. 采用划线接种法，从冷冻保存的菌种中在富含营养的琼脂平板（如胰蛋白胨大豆琼脂，见材料表）上获得S. aureus的单菌落。
2. 用100 µL无菌H₂O稀释的0.001%（v/v）聚-L-赖氨酸（PLL）包被96孔板的各个孔，室温孵育30分钟。在无菌条件下，使用真空辅助吸液装置吸除PLL溶液。室温下让各孔干燥过夜。
   注意：除非另有说明，本方案中所有吸液步骤均使用真空辅助吸液装置进行。
3. 将S. aureus单菌落接种于添加2%葡萄糖的最低必需培养基α（MEMα）中，制备过夜培养物，并于37 °C、200 rpm振荡培养16–18小时。
4. 取50 µL过夜培养物转移至5 mL新鲜的含2%葡萄糖的MEMα培养基中，于37 °C、200 rpm振荡培养至对数中期，通常光密度600（OD₆₀₀nm）达到0.5–0.8。使用MEMα将对数中期培养物调整至OD₆₀₀nm为0.1。
5. 将150 µL调整后的菌液转移至经PLL处理的96孔板各孔中。在37 °C湿润培养箱中静置培养18–20小时。
   注意：生物膜也可在其他装置中培养，例如µ通道载玻片（见材料表）。
6. 吸除上清液以去除浮游细胞。用150 µL Hank's平衡盐溶液（HBSS）轻轻洗涤残留的生物量，以去除未附着的细胞。滴加HBSS时应逐滴加入，避免破坏生物膜。
   注意：在吸除上清液和洗涤过程中HBSS时，应保留刚好足够的液体（上清液或HBSS）在含有生物膜的孔中，使生物膜仍处于浸没状态。这可防止在滴加HBSS洗涤时破坏生物膜结构。
7. 重复步骤1.6至少两次以上，以彻底清除所有浮游细胞。此时，生物膜已准备好用于后续实验。
   注意：若生物膜不用于中性粒细胞实验，可用磷酸盐缓冲液（PBS）替代HBSS。推荐使用HBSS而非PBS，因为HBSS含有葡萄糖等成分，可为中性粒细胞活化提供最佳条件。

2. 中性粒细胞分离

注意：中性粒细胞的分离采用先前发表的方法并稍作修改。该分离方案首先进行密度梯度离心，随后进行3%右旋糖酐沉降。本节仅概述中性粒细胞分离的整体流程，重点介绍对已发表方案所做的修改。此外，下述方案仅为多种可分离中性粒细胞的方法之一，可根据需要替换。其他中性粒细胞分离方法包括使用细胞分离介质或磁珠抗体细胞分离技术。

1. 从成年供体采血 通过 根据机构伦理审查委员会（IRB）规定的方案进行静脉穿刺。采血前，确保注射器中含有足量的无防腐剂肝素，使肝素的终浓度为20 U/mL。
2. 用无内毒素的0.9% NaCl溶液以相当于肝素化血液3/4体积的量进行稀释（参见 材料表) 在 H₂室温下
3. 每20 mL稀释后的血样，加入14 mL市售密度梯度介质（参见 材料表) 转移至新的50 mL锥形管中。将稀释后的血液样本小心地铺加在密度梯度介质上方。
4. 将分层的血液样本在400 x g条件下离心 g 室温下离心40分钟。确保离心机设置为慢速刹车，以避免离心结束后扰动分层。
   注意： 血液样本将分为五层，依次为含有生理盐水和血浆的混合层、单个核细胞层、密度梯度介质层、中性粒细胞层以及红细胞层。
5. 使用血清学移液管吸除中性粒细胞和红细胞沉淀物上方的所有液层，随后用冷的无内毒素0.9% NaCl溶液轻轻重悬沉淀物₂O. 对于每份由20 mL血液样本获得的沉淀物，将沉淀重悬至总体积20 mL。加入等体积的3%右旋糖酐（见 材料表将离心管直立放置于冰上孵育18-20分钟。
   注意： 确保使用无内毒素的0.9% NaCl配制3%葡聚糖溶液₂O.
6. 将含有中性粒细胞和部分红细胞的上层液体20 mL转移至新的50 mL锥形管中，于355 x g离心 g 4 °C 下离心 10 分钟。弃去上清液，留下红色沉淀。
7. 轻轻将沉淀重悬于10 mL冷的无菌H₂O，持续30秒以裂解残留的红细胞。立即向混合物中加入10 mL冷的无内毒素0.9%生理盐水以恢复等渗状态。将溶液在233 x g 4 °C下持续3分钟。
8. 弃去上清液，将含有95%-97%中性粒细胞的沉淀物重悬于每20 mL血液样本加入1 mL冷的HBSS中。
9. 将10 µL重悬的中性粒细胞转移至90 µL 0.4%台盼蓝排斥染料中，使用血细胞计数板进行细胞计数（参见 材料表).
   注意： 非活细胞因无法排斥台盼蓝染料而被染成蓝色。本方案提供 >99% 细胞活力
10. 加入额外的HBSS，使中性粒细胞的最终浓度为4 x 10⁶ cells/mL
    注意： 对于某些情况 <99% 细胞活力，终浓度为 4 x 10⁶ 细胞/mL 仍可实现；然而，含有 4 x 10 的溶液总体积⁶ 细胞/mL 的获得量将会减少。最终的中性粒细胞浓度可根据使用者的实验需求进行调整。中性粒细胞被重悬至 4 x 10⁶ 细胞/mL 作为以下所有实验的终浓度。为考虑供体间的个体差异，强烈建议所有涉及中性粒细胞的实验至少使用三个不同供体的样本进行。

3. 成像生物膜与中性粒细胞的相互作用

1. 使用步骤 1.2–1.6 建立生物膜。为便于生物膜成像，可采用表达绿色荧光蛋白（GFP）的荧光标记金黄色葡萄球菌（S. aureus）菌株（如 USA300），以提高显微镜成像的便利性。
   注意：本实验中使用 6 通道 µ-载玻片（见材料表）替代 96 孔板，以演示体外（in vitro）生物膜模型（步骤 1）。
2. 将浓度为 4 × 10⁶ 个细胞/mL 的中性粒细胞与 100 µM 的 Blue CMAC（7-氨基-4-氯甲基香豆素）染料（BCD，见材料表）在 37 °C、5% CO₂ 条件下于摇床上孵育 30 分钟。确保样品避光孵育，并在后续步骤中尽量减少光照暴露。
3. 为洗去多余的 BCD，将中性粒细胞在 270 × g 条件下离心 5 分钟，吸除上清液，然后用新鲜的 HBSS 重悬细胞。此时，向 BCD 标记的中性粒细胞中加入终浓度为 4 µM 的碘化乙啶同型双聚体-1（ethidium homodimer-1，见材料表），以监测中性粒细胞和细菌的死亡情况。
4. 将 150 µL 中性粒细胞悬液加入已在 µ-载玻片中形成的 S. aureus 生物膜中，使中性粒细胞与细菌的比例为 1:30（中性粒细胞:细菌）。将 µ-载玻片置于湿化孵育盒中孵育 30 分钟。细菌细胞数量基于 18 小时生物膜平板计数所得结果确定。
5. 使用与荧光染料/蛋白激发和发射波长相对应的荧光通道，对中性粒细胞与生物膜的相互作用进行成像。
   注意：在本研究中，BCD 的激发/发射波长为 353/466 nm，碘化乙啶同型双聚体-1 为 528/617 nm，GFP 为 395/509 nm。应尽量减少样品对激光或光源的暴露时间，以防止样品发生光漂白。
6. 使用显微图像分析软件或程序（如 FIJI/ImageJ、COMSTAT2、BiofilmQ 和 BAIT 等）对图像进行分析。
   注意：使用染料时，需注意所用染料的特异性。某些染料可同时标记原核和真核细胞，而另一些则仅对其中一类细胞有效。若中性粒细胞和生物膜分别使用可同时标记两类细胞的染料进行染色，则在将两者混合前必须彻底洗去残留染料，以避免交叉染色。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.9% 氯化钠注射液，符合美国药典标准	Baxter	2F7124	无内毒素；用于中性粒细胞分离
150 mL 快速流过滤装置	Thermo Scientific	565-0020
200 proof 乙醇	VWR	89125-188
3 mL 注射器	BD	309657	用于采血
50 mL 圆锥形离心管	Thermo Scientific	339652
60 mL 注射器	BD	309653	用于采血
琼脂	Fisher Bioreagents	BP1423-2
酒精棉片	BD		用于采血
创可贴			用于采血
BD Bacto 胰蛋白胨大豆肉汤	BD	DF0370-07-5	与 1.5% 琼脂混合制备胰蛋白胨大豆琼脂
细胞计数仪	Bal Saupply	202C
CellTracker 蓝 CMCH	Invitrogen	C2111	蓝色 CMAC 染料（BCD）
透明底 96 孔平底聚苯乙烯板	Costar	3370
棉质纱布	Fisherbrand	13-761-52	用于采血
培养管	Fisherbrand	14-961-27	硼硅酸盐玻璃 13 x 100 mm
D-(+)-葡萄糖	Sigma	G-8270
来自 Leuconostoc spp. 的葡聚糖	Sigma	31392-250G	用于中性粒细胞分离
杜尔贝科氏磷酸盐缓冲液（DPBS）1x	Gibco	14190-144
溴化乙锭同聚体-1	Invitrogen	L3224 B
Ficoll-Paque Plus	Cytiva	17144003	用于中性粒细胞分离（密度梯度介质）
汉克斯平衡盐溶液（HBSS）1x	Corning cellgro	21-022-CV	不含钙、镁和酚红
血细胞计数板	Bright Line
肝素	Novaplus	NDC 63323-540-57	1000 USP 单位/mL，用于采血
IMARIS 9.8	Oxford Instruments		显微镜图像分析软件
最低必需培养基（MEM）Alpha 1x	Gibco	41061-029
针头（23 G1）	BD	305145	用于采血
Nikon Eclipse Ti2	Nikon
NIS-Elements	Nikon		死亡中性粒细胞的定量分析
聚-L-赖氨酸溶液	Sigma	P4707-50ML
氯化钠	Fisher Bioreagents	BP358-10	用于中性粒细胞分离
无菌冲洗用水，符合美国药典标准	Baxter	2F7114	无内毒素；用于中性粒细胞分离
Surflo 翼状输液套件	Terumo	SC*19BLK	19 G x 3/4"，用于采血
台盼蓝染液（0.4%）	Gibco	15250-061
止血带			用于采血
UltraPure 去离子水	Invitrogen	10977015
白色不透明 96 孔板	Falcon	353296	组织培养处理，平底板
μ-Slide VI 0.4	Ibidi	80601	μ通道载片