一种用于研究中性粒细胞与生物膜相互作用的体外实验方法

摘要

来源：Rana, P. S. J. B. 等. 标准化 体外 可视化和定量分析人中性粒细胞相互作用的实验方法 Staphylococcus aureus 生物膜 视频实验杂志 (2022)

本视频演示了一种 体外 研究中性粒细胞与生物膜相互作用的检测方法。将嵌入生物膜中的致病菌和分离的中性粒细胞用荧光标记物标记，利用荧光显微镜评估中性粒细胞的免疫反应以及细菌对免疫反应的逃逸。

方案

1. 准备 体外 生物膜

1. 采用划线接种法，从冷冻保存的菌种中在富含营养的琼脂平板（如胰蛋白胨大豆琼脂，见材料表）上获得S. aureus的单菌落。
2. 用100 µL无菌H₂O稀释的0.001%（v/v）聚-L-赖氨酸（PLL）包被96孔板的各个孔，室温孵育30分钟。在无菌条件下，使用真空辅助吸液装置吸除PLL溶液。室温下让各孔干燥过夜。
   注意：除非另有说明，本方案中所有吸液步骤均使用真空辅助吸液装置进行。
3. 将S. aureus单菌落接种于添加2%葡萄糖的最低必需培养基α（MEMα）中，制备过夜培养物，并于37 °C、200 rpm振荡培养16–18小时。
4. 取50 µL过夜培养物转移至5 mL新鲜的含2%葡萄糖的MEMα培养基中，于37 °C、200 rpm振荡培养至对数中期，通常光密度600（OD₆₀₀nm）达到0.5–0.8。使用MEMα将对数中期培养物调整至OD₆₀₀nm为0.1。
5. 将150 µL调整后的菌液转移至经PLL处理的96孔板各孔中。在37 °C湿润培养箱中静置培养18–20小时。
   注意：生物膜也可在其他装置中培养，例如µ通道载玻片（见<....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.9% 氯化钠注射液，符合美国药典标准	Baxter	2F7124	无内毒素；用于中性粒细胞分离
150 mL 快速流过滤装置	Thermo Scientific	565-0020
200 proof 乙醇	VWR	89125-188
3 mL 注射器	BD	309657	用于采血
50 mL 圆锥形离心管	Thermo Scientific	339652
60 mL 注射器	BD	309653	用于采血
琼脂	Fisher Bioreagents	BP1423-2
酒精棉片	BD		用于采血
创可贴			用于采血
BD Bacto 胰蛋白胨大豆肉汤	BD	DF0370-07-5	与 1.5% 琼脂混合制备胰蛋白胨大豆琼脂
细胞计数仪	Bal Saupply	202C
CellTracker 蓝 CMCH	Invitrogen	C2111	蓝色 CMAC 染料（BCD）
透明底 96 孔平底聚苯乙烯板	Costar	3370
棉质纱布	Fisherbrand	13-761-52	用于采血
培养管	Fisherbrand	14-961-27	硼硅酸盐玻璃 13 x 100 mm
D-(+)-葡萄糖	Sigma	G-8270
来自 Leuconostoc spp. 的葡聚糖	Sigma	31392-250G	用于中性粒细胞分离
杜尔贝科氏磷酸盐缓冲液（DPBS）1x	Gibco	14190-144
溴化乙锭同聚体-1	Invitrogen	L3224 B
Ficoll-Paque Plus	Cytiva	17144003	用于中性粒细胞分离（密度梯度介质）
汉克斯平衡盐溶液（HBSS）1x	Corning cellgro	21-022-CV	不含钙、镁和酚红
血细胞计数板	Bright Line
肝素	Novaplus	NDC 63323-540-57	1000 USP 单位/mL，用于采血
IMARIS 9.8	Oxford Instruments		显微镜图像分析软件
最低必需培养基（MEM）Alpha 1x	Gibco	41061-029
针头（23 G1）	BD	305145	用于采血
Nikon Eclipse Ti2	Nikon
NIS-Elements	Nikon		死亡中性粒细胞的定量分析
聚-L-赖氨酸溶液	Sigma	P4707-50ML
氯化钠	Fisher Bioreagents	BP358-10	用于中性粒细胞分离
无菌冲洗用水，符合美国药典标准	Baxter	2F7114	无内毒素；用于中性粒细胞分离
Surflo 翼状输液套件	Terumo	SC*19BLK	19 G x 3/4"，用于采血
台盼蓝染液（0.4%）	Gibco	15250-061
止血带			用于采血
UltraPure 去离子水	Invitrogen	10977015
白色不透明 96 孔板	Falcon	353296	组织培养处理，平底板
μ-Slide VI 0.4	Ibidi	80601	μ通道载片