通过结肠组织切片的免疫组织化学分析评估化学诱导的结肠炎

所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审查。

1. 小鼠和 DSS 的制备

1. 将敲除 （α-gustducin ^{- / -} ） 小鼠和年龄、性别和体重匹配的野生型 （α-gustducin ^{+ / +}） C57BL / 6小鼠分别保存在干净的笼子中><。 注意:基因敲除小鼠已与 C57BL/6 小鼠回交超过 20 代，具有近 100% 的 C57BL/6 遗传背景。
2. 将 30 g 葡聚糖硫酸钠 （DSS） 粉末溶于 1 L 高压灭菌水中。混合直至溶液澄清，以确保最终工作浓度为 3% （w/v><）。 注意:DSS 溶液可在室温下储存长达 1 周或在 4 °C 下储存直至使用。

2. 小鼠 DSS 结肠炎的诱导和评估

1. 称重并记录每只小鼠的初始体重。将小鼠单独放入标准塑料笼中并标记笼子。
2. 用 3% DSS 溶液代替常规饮用水，总共 7 天，两组小鼠都可以随意使用。
3. 测量小鼠的体重，记录 DSS 溶液的消耗量，并在 DSS 给药期间每天收集和检查每只小鼠的粪便。观察腹泻和直肠出血的严重程度，并将其转换为 DSS 诱导的疾病指数。
4. 在实验过程中，计算体重减轻与初始体重和疾病指数相比的百分比，以评估结肠炎的症状><。 注意:疾病指数通过结合腹泻和直肠出血的观察结果进行评分，定义如下:0（正常便，无血）、1（软便，无血）、2（软便，少量血）、3（非常软便，中度出血）和 4（水样便，大量出血）。每天分析每只小鼠的疾病指数。
5. 在 7 天 DSS 治疗结束时，通过颈椎脱位处死小鼠并继续进行其余实验。

3. 组织样品的制备

1. 将鼠标置于仰卧位，用 70% 乙醇清洁腹部皮肤。用一把小剪刀在腹部做一个 3 厘米长的中线切口，露出腹腔。
2. 用一把镊子小心地将脾脏与其他组织分开，然后取出脾脏并测量其大小。
3. 识别并用镊子提起结肠，并将其与周围的肠系膜分开。拉出整个结肠，直到可以看到盲肠和直肠。
4. 通过在结肠盲肠边缘和骨盆深处横切结肠来分离结肠，以分别释放近端和远端结肠。然后，测量并记录孤立结肠的长度。在解剖过程中小心不要损坏结肠组织。
5. 用装有管饲针的 10 mL 注射器用 10 mL 冰冷的磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 冲洗结肠，以去除粪便和血液，直到洗脱液完全透明。
6. 为了进行组织学鉴定，将组织样本平均分为三个部分:近端、中端和远端。然后，用 4% 多聚甲醛 （PFA） 在 4 °C 下固定组织过夜。
7. 为了分析细胞因子表达，用液氮快速冷冻整个结肠并将其储存在 -80 °C 直至使用。

4. DSS 诱导结肠炎严重程度的组织学评估

1. 免疫组化
   1. 固定后，将组织浸入 30% 蔗糖的 1x PBS 溶液中过夜，置于 15 mL 试管中，以冷冻保护样品。
   2. 将组织包埋在最佳切割温度 （OCT） 化合物中，并将其置于 -20 °C 直至 OCT 硬化。
   3. 将含有组织的 OCT 块转移到低温恒温器中，将低温恒温器中的厚度刻度盘设置为 12 μm，然后切片并收集 12 μm 厚的冷冻切片。
   将
   4. 低温恒温器中收集的组织切片在 65 °C 下在热板上加热 20 分钟。在 1x PBS 中洗涤切片 3 次，每次 10 分钟。将组织切片在 3% 过氧化氢中孵育 10 分钟，以去除内源性过氧化物酶。将切片再清洗 3 次。在室温下用封闭缓冲液（3% 牛血清白蛋白 （BSA）、0.3% 非离子洗涤剂、2% 山羊血清、0.1% 叠氮化钠在 1x PBS 中）封闭组织 1 小时或更长时间。
   5. 用含有以下免疫细胞类型特异性一抗的溶液替换封闭缓冲液:用于白细胞的 CD45、用于 T 细胞的 CD3、用于 B 细胞的 B220、用于巨噬细胞的 CD11b 和用于中性粒细胞的 Ly6G。在 4 °C 孵育过夜。
   6. 通过抽吸从组织切片中去除一抗。用 1x PBS 洗涤切片 3 次，每次 10 分钟。用生物素化二抗孵育切片，然后在室温下与链霉亲和素-HRP 复合物孵育。
   7. 用 3,3'-二氨基联苯胺 （DAB） 溶液孵育切片，形成浅棕色或深棕色，并观察免疫反应细胞。
   8. 用苏木精和 0.3% （v/v） 稀释氨对切片进行复染。在显微镜下以 10 倍放大倍率拍摄明场图像。
   9. 使用图像处理程序通过设置 2 个掩码来识别和量化上皮和固有层（上皮下方）中标记的免疫细胞群:使用基于颜色立方体的功能中的第一个掩码设置颜色检测阈值并测量有色的 DAB 反应区域;使用第二个掩码确定检查部分中上皮和层状固有体的总面积。将免疫反应细胞群表示为浸润细胞的染色面积与检查组织总面积的比率。