通过结肠组织切片的免疫组织化学分析评估化学诱导性结肠炎

摘要

来源：Du, Y. W. 等，味觉信号蛋白缺失对炎症性肠病小鼠模型肠道炎症的影响 J. Vis. Exp. (2018)

本视频展示了化学诱导性结肠炎的评估方法 通过 小鼠结肠组织的免疫组织化学染色。在染色的组织切片中，受损组织内大量免疫反应性细胞的存在代表结肠炎期间免疫细胞的浸润。

方案

所有涉及动物模型的操作均已被当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 小鼠和DSS的准备

1. 将敲除（α-gustducin^-/-）小鼠与年龄、性别和体重相匹配的野生型对照（α-gustducin^+/+）C57BL/6 小鼠分别饲养于清洁的笼具中。
   注意： 敲除小鼠已与 C57BL/6 小鼠回交超过 20 代，具有近 100% 的 C57BL/6 遗传背景。
2. 将 30 g 右旋糖酐硫酸钠（DSS）粉末溶于 1 L 的高压灭菌水中，搅拌至溶液澄清，以确保最终工作浓度为 3%（w/v）。
   注意： DSS 溶液可在室温下保存最多 1 周，或置于 4 °C 保存至使用前。

2. 小鼠DSS结肠炎的诱导与评估

1. 称重并记录每只小鼠的初始体重。将小鼠分别放入标准塑料笼中，并标记笼子。
2. 将普通饮用水替换为3% DSS溶液，连续供应7天，两组小鼠均可 ad libitum自由饮用。
3. 在DSS处理期间，每天测量小鼠体重，记录DSS溶液消耗量，并收集和检查每只小鼠的粪便。观察腹泻和直肠出血的严重程度，并将其转换为DSS诱导的疾病指数。
4. 实验过程中，通过计算相对于初始体重的体重下降百分比和疾病指数来评估结肠炎症状。
   注意：疾病指数根据腹泻和直肠出血的观察结果综合评分，定义如下：0分（粪便正常，无出血），1分（粪便偏软，无出血），2分（粪便偏软，少量出血），3分（粪便很软，中度出血），4分（水样便，明显出血）。每只小鼠的疾病指数每日进行分析。
5. 在7天DSS处理结束后，通过颈椎脱臼法处死小鼠，并继续进行后续实验。

3. 组织样本的制备

1. 将小鼠置于仰卧位，用70%乙醇清洁腹部皮肤。用小型剪刀在腹部做一条3 cm长的正中切口，暴露腹腔。
2. 使用镊子小心分离脾脏与其他组织，随后取出脾脏并测量其大小。
3. 用镊子识别并提起结肠，将其与周围肠系膜分离。将整个结肠拉出，直至盲肠和直肠可见。
4. 在结肠-盲肠交界处和盆腔深部横断结肠，分别游离近端和远端结肠。然后测量并记录分离后结肠的长度。解剖过程中注意避免损伤结肠组织。
5. 使用配备灌胃针头的10 mL注射器，以10 mL冰冷的磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗结肠，清除粪便和血液，直至流出液完全澄清。
6. 用于组织学鉴定时，将组织样本均分为三部分：近端、中段和远端。然后将组织在4%多聚甲醛（PFA）中固定，4 °C过夜。
7. 用于细胞因子表达分析时，用液氮迅速冷冻整个结肠，并于-80 °C保存至使用。

4. DSS诱导型结肠炎严重程度的组织学评估

1. 免疫组织化学
   1. 固定后，将组织置于含有30%蔗糖的1x PBS溶液中，在15 mL离心管中4 °C过夜，以对样本进行冷冻保护。
   2. 将组织包埋于最佳切割温度（OCT）包埋剂中，并置于-20 °C直至OCT完全凝固。
   3. 将含有组织的OCT包埋块转移至冷冻切片机，将切片厚度设定为12 µm，切取并收集厚度为12 µm的冷冻切片。
   4. 将冷冻切片机收集的组织切片置于65 °C加热板上加热20分钟。用1x PBS洗涤切片3次，每次10分钟。加入3%过氧化氢溶液，室温孵育10分钟以灭活内源性过氧化物酶活性，随后再用1x PBS洗涤3次。使用封闭缓冲液（含3%牛血清白蛋白（BSA）、0.3%非离子型去污剂、2%山羊血清和0.1%叠氮化钠的1x PBS溶液）在室温下封闭组织切片1小时或更长时间。
   5. 吸除封闭液，更换为含以下免疫细胞类型特异性一抗的溶液：CD45（白细胞标记）、CD3（T细胞标记）、B220（B细胞标记）、CD11b（巨噬细胞标记）和Ly6G（中性粒细胞标记），4 °C孵育过夜。
   6. 吸除一抗溶液，用1x PBS洗涤切片3次，每次10分钟。加入生物素标记的二抗室温孵育，随后再加入链霉亲和素-辣根过氧化物酶（streptavidin-HRP）复合物，室温孵育。
   7. 加入3,3'-二氨基联苯胺（DAB）显色液孵育，使阳性信号呈现浅棕色或深棕色，以显示免疫反应性细胞。
   8. 使用苏木精和0.3%（v/v）稀释氨水对切片进行复染。在显微镜下以10倍物镜采集明场图像。
   9. 使用图像处理软件，通过设置两个掩膜来识别并定量上皮层及固有层（上皮下方）中标记的免疫细胞数量：第一个掩膜基于颜色立方体特征设定颜色检测阈值，用于测量呈DAB阳性反应的着色区域面积；第二个掩膜用于确定所观察切片中上皮层和固有层的总面积。将免疫反应性细胞的数量表示为浸润细胞染色面积与所观察组织总区域面积的比值。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗体
CD45	BD Biosciences	550539
CD3	BD Biosciences	555273
B220	BD Biosciences	550286
CD11b	BD Biosciences	550282
Ly6G	BD Biosciences	551459
试剂
Dextran Sulfate Sodium Salt (DSS)	MP Biomedicals	2160110
Streptavidin-HRP complex	BD Pharmingen	551011
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Sangon Biotech	B548117
BD 10 ml Syringe	BD Biosciences	309604
仪器与设备
天平
剪刀
镊子
染色缸
软件
Imag-Pro Plus	Media Cybernetics, Inc.