通过暴露于烟草制品处理的外周血单个核细胞杀伤K562细胞

摘要

来源：Arimilli, S. 等，可燃烟草产品制剂细胞毒性和免疫抑制作用的评估方法。J. Vis. Exp. (2015)

在本视频中，我们研究了全烟雾条件培养基（一种可燃烟草制品的制备物）对效应外周血单个核细胞杀伤 K562 细胞的影响。

方案

1. K562 杀伤实验

注意：K562 细胞应在含完全 RPMI 培养基的条件下，于 37 °C 和 5% CO₂ 培养箱中培养，直至细胞融合度达到 80% 后再进行实验。

1. 通过向小瓶中加入 18 µl DMSO，制备 5 mM 羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）储备液。
2. 在96孔板中，使用完全RPMI培养基将WS-CM或尼古丁稀释至每孔总体积为100 µl，以获得各孔所需的等尼古丁单位或尼古丁浓度。
   注意： 尼古丁具有急性毒性和环境危害性。
3. 将100 µl浓度为1.5 × 10⁶个/mL的PBMC加入RPMI完全培养基中⁶ 每孔细胞总量（含WS-CM或尼古丁）为200 µl/孔。
4. 盖上培养板，在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下孵育 3 小时₂.
5. 用 10 ml DPBS 洗涤 K562 细胞，然后在 400 x g 条件下离心 g 室温下持续 8 分钟。
6. 用10 ml DPBS重悬细胞，并计数K562细胞。
7. 将1 µl CFSE储备液加入1 ml DPBS中，配制CFSE工作液。
8. 向含有 1 - 2 x 10⁶ 个 K562 细胞的 1 ml 细胞悬液中加入 1 ml CFSE 工作液⁷ 细胞。涡旋并精确在室温下孵育2分钟。
9. 立即加入 200 μl FBS，涡旋混匀后在室温下准确孵育 2 分钟。
10. 加入 10 ml RPMI 完全培养基，将试管在 400 x g 室温下持续8分钟。
11. 移除 RPMI 上清液，重悬细胞沉淀，加入 10 ml RPMI 完全培养基重悬细胞，计数 CFSE 标记的 K562 细胞。
12. 通过在 300 x g 条件下离心培养板，洗涤 PBMCs g 室温下孵育3分钟。通过倾倒去除上清液。盖上盖子后涡旋振荡板底。加入200 µl完全RPMI培养基，再重复洗涤步骤一次。
13. 以1:15的比例加入CFSE标记的K562细胞（100,000个K562细胞：1.5 × 10⁶个效应细胞）⁶ 将PBMCs加入PBMC板的每个样本孔中，于37 °C和5% CO₂条件下继续孵育5小时₂.
14. 以 300 × g 离心 3 分钟（室温）洗涤细胞混合物。弃去上清液，移除液体。盖上盖子，涡旋混匀板底部。
15. 加入200 µl电泳缓冲液，重复步骤14中所述的洗涤步骤一次。
16. 每孔加入95 µl运行缓冲液和5 µl 7AAD，总体积为100 µl/孔。室温避光孵育15分钟。
17. 向每个孔中加入 100 µl 跑胶缓冲液，将每孔细胞悬液全部转移至流式管中，并在流式细胞仪上检测样品。
18. 使用流式细胞术分析软件确定 7AAD 阳性与 CFSE 阳性细胞的百分比。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
12 × 75 离心管	BD Falcon	352058
15 ml 锥形离心管	Corning	430790
2 mL 微量离心管	Axygen	MCT-150-C-S
50 ml 锥形离心管	Corning	430828
500 ml 瓶	Corning	430282
7AAD	BD Pharmingen	559925
96 孔平底培养板	Thermo Nunc	439454
96 孔圆底培养板	BD Falcon	353077
细胞培养超净台	Thermo Scientific	1300 Series A2
离心机	Eppendorf	58110R
CFSE	Molecular Probes Life Technologies	C34554
Cluster 管	Corning	4401	吞咽有害，致癌物
DMSO（二甲基亚砜）	Sigma-Aldrich	D8418
DPBS	Lonza	17-512F
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
滤器装置	Nalgene	156-4020
流式细胞仪	BD Biosciences	FACS Canto II	在激发波长 405 nm 和发射波长 785 nm 下支持 8 色检测。
流式细胞仪	BD Biosciences	FACS Calibur	在激发波长 495 nm 和发射波长 785 nm 下支持 4 色检测。
流式细胞术分析软件	Tree Star	FlowJo
尼古丁	Sigma-Aldrich	N3876	急性毒性，环境危害
Parafilm 封口膜	Bemis	"M"
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	P6148	易燃，皮肤刺激
青霉素/链霉素溶液（Pen/strep）	Gibco Life Technologies	15140-122
RPMI 1640 培养基	Gibco Life Technologies	11875-093
运行缓冲液	MACS 运行缓冲液，Miltenyi Biotech	130-091-221
移液吸头	Fisher Scientific	13-711-20
Tris 碱	Sigma-Aldrich	T1503