一种用于研究抗菌治疗对细菌聚集体作用的体外技术

摘要

来源：Gannon, A. D., 等. 用于实时评估的工具 铜绿假单胞菌 感染模型 视频实验杂志 (2021).

本视频演示了一种 体外 研究抗菌治疗影响的技术 铜绿假单胞菌 （Pa）聚集体。用荧光标记的Pa细胞培养成聚集体，以模拟其在感染过程中的生长模式。当用亚致死浓度的抗生素多粘菌素挑战这些聚集体时，可实时评估细菌与抗生素之间的相互作用。 通过 荧光显微镜技术

方案

1. 配制合成囊性纤维化培养基（SCFM2）

注意：SCFM2 的制备包含以下三个主要步骤 （图 1）。

1. 猪黏蛋白的灭菌
   1. 将黏蛋白配制成终浓度为 5 mg/mL 的 SCFM2 无菌溶液。例如，对于 5 mL 的 SCFM2 溶液，称取 25 mg II 型黏蛋白置于无菌培养皿中，放入紫外（UV）灭菌器中处理 4 小时，每小时轻轻振荡一次。
   2. 4 小时后，在无菌条件下将经 UV 处理的黏蛋白转移至已高压灭菌的 1.7 mL 离心管中，于 -20 °C 保存。
   3. 为确认完全灭菌，取少量黏蛋白溶于无菌液体（如水或LB肉汤）中，在显微镜下观察。
      注意： 灭菌后的黏蛋白可在 -20 °C 下保存长达 6 个月。
2. 缓冲基础液的制备
   1. 按表 1 所列质量，将相应量的盐和氨基酸溶解于去离子水中，配制储备液。使用 0.22 μm 滤器对所有储备液进行过滤灭菌，用铝箔包裹以避免光照降解，并于 4 °C 保存，最长可保存一个月。
   2. 将 190 mL 去离子水与表 1 所列体积的氨基酸和盐储备液混合，配制缓冲基础液。调节溶液 pH 至 6.8，并定容至 250 mL。使用 0.22 μm 滤器过滤灭菌后，于 4 °C 保存，最长可保存 30 天。
   3. 实验前一天晚上，将所需量的缓冲基础液分装至玻璃培养瓶中，加入黏蛋白（终浓度 5 mg/mL，如步骤 1.1.1 所述）和纯化的鲑鱼精 DNA（终浓度 0.6 mg/mL）。轻轻振荡混匀，用铝箔包裹后于 4 °C 过夜，使黏蛋白和 DNA 充分溶解。
      注意： 鲑鱼精 DNA 分装样品应在冰上解冻，涡旋混匀后加入缓冲基础液和黏蛋白中。色氨酸、天冬酰胺和酪氨酸储备液需用 NaOH 溶液配制（浓度见表 1），而非去离子水。所有缓冲基础液及储备液均需用铝箔包裹，避免光照。大多数储备液可稳定保存一个月。若储备液出现变色，则不应使用，须更换新配制的溶液。
3. 添加补充储备液
   1. 实验当天，将表 2 所列的储备液加入含黏蛋白和 DNA 的缓冲基础液中。
      注意： FeSO₄ 溶液需在实验当天新鲜配制，其余储备液可提前配制并在 4 °C 保存 30 天。1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（DOPC）含有氯仿，操作时应小心，避免靠近明火。加入 DOPC 后，将 SCFM2 在 37 °C 摇床（250 rpm）中孵育至少 20 分钟（适用于 5 mL 培养体系），以使 DOPC 中的氯仿充分挥发。培养瓶不应完全密封，可用铝箔松散覆盖瓶口。

2. 细菌聚集体中抗菌耐受性的实时评估

1. 准备过夜培养物
   1. 实验前一晚，从含有抗生素（羧苄西林 300 μg/mL）的 LB 琼脂平板上挑取数个 Pa PAO1-pMRP9-113 菌落，接种于 5 mL LB 肉汤培养基中。在 37 °C、250 rpm 振荡条件下过夜培养。
      注意：过夜培养时需添加筛选所需质粒（此处为绿色荧光蛋白（GFP）表达质粒 pMRP9-1）所需的抗生素。Pa 菌体在接种 SCFM2 前需进行洗涤。LB 可替换为其他适合的富集培养基用于过夜培养。所有细菌分离株在整个实验过程中均应按照适当的 BSL-2 指南进行操作。
2. 接种 SCFM2
   1. 实验当天，将 Pa 的过夜培养物按 1:10（培养物：液体培养基）的比例稀释，取 500 μL 接种至 5 mL 新鲜 LB 肉汤培养基中。在 37 °C、250 rpm 振荡条件下培养至对数生长期（60–90 分钟）。
   2. 将对数生长期的培养物在 10,000 × g 条件下离心 5 分钟。弃上清液，用 3 mL 经滤膜除菌的磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.0）重悬菌体，洗涤一次。重复该步骤两次，最终将菌体沉淀重悬于 1 mL PBS 中。
   3. 使用分光光度计在 600 nm 处测定洗涤后菌液的吸光度（OD600），并计算在 5 mL SCFM2 中起始 OD600 为 0.05 所需的菌液体积。将 Pa 接种至 SCFM2 中，轻轻涡旋混匀以使菌体均匀分布。将 1 mL 接种后的 SCFM2 分别加入 4 孔玻璃底光学培养皿的每个孔中，在 37 °C 静置培养 4 小时。
      注意：Pa 菌体的倍增时间取决于菌株种类及氧气供应情况。在本实验所述条件下，SCFM2 中 Pa 的倍增时间约为 1.4 小时。

3. 使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察抗生素处理过程中的聚集体

注意：本节介绍使用共聚焦激光扫描显微镜及图像采集软件对 SCFM2 中的 Pa 聚集体进行成像的方法。目的是观察和表征经抗生素处理后残留的（耐受性）细菌生物量。所述步骤也可在其他共聚焦显微镜上成功实施，但应参考仪器操作手册以获取具体指导。

1. 使用带有加热腔室或安装在显微镜载物台上的加热微孔板对Pa培养物进行成像，以维持37 °C的环境温度。在实验开始前至少2小时启动孵育模块，使所有设备达到目标温度，并减少数据采集过程中的进一步膨胀和移动。
2. 4小时后，将含有Pa细胞的SCFM2培养物转移至加热的显微镜载物台上。将4个孔中的3个指定为抗生素处理的技术重复，第4个孔作为无处理对照，仅含SCFM2中的Pa细胞，不添加抗生素。在激发荧光报告基因之前，使用明场显微镜在定位标签中识别聚集体。为每个孔定义成像区域，并使用成像软件中的位置模块存储其位置（x-y-z坐标）。
3. 使用63倍油浸物镜，在激发波长488 nm、发射波长509 nm条件下，观察含有GFP表达质粒pMRP9-1的SCFM2中Pa培养物。在采集模块中使用z轴堆叠选项，以1 μm间隔获取图像（共60层）。使用线平均模块降低GFP通道在60 μm z轴堆叠图像总体积（1,093.5 mm³）中的背景荧光。使用相同设置获取未接种SCFM2的对照图像，用于图像分析时确定背景荧光。
   注意：图像通过生成512像素 × 512像素（0.26 μm × 0.26 μm像素）的8位z轴堆叠图像获得，成像范围距盖玻片底部60 μm。
4. 使用成像软件中的时间序列选项，在18小时内每隔15分钟对每个位置（孔）采集60层图像。使用软件中的确定性聚焦策略为每个位置保存一个焦平面，确保在整个实验过程中每个时间点均能返回至该焦平面。
5. 在总共4.5小时的孵育后，使用上述设置对每个位置进行成像，以确定添加抗生素前四个孔中各聚集体的生物量。
6. 在总共6小时的孵育后，向每个重复孔中加入最低抑菌浓度（MIC）2倍以下浓度的抗生素。将抗生素溶液轻柔地直接移入孔中央，位置略低于气液界面。所有培养物均保留在加热的共聚焦培养室内。
   注意：本实验中使用硫酸多粘菌素（colistin sulfate），浓度为140 μg/mL。
7. 通过点击成像程序中的开始实验选项，启动抗生素处理后的成像。
   注意：所用抗生素浓度取决于抗生素种类、Pa分离株以及用户希望研究杀菌效应还是耐受效应。本实验采用单次给药。如有需要，可在不干扰培养物的情况下追加额外剂量。

4. Pa 聚集体的碘化丙啶染色

注意：碘化丙啶（PI）通常用作染色试剂，以识别培养物中非活性（死亡）的细菌细胞。在此实验中，它用于识别在第3节中经抗生素处理后敏感的聚集体。在整个实验方案中，Pa细胞中GFP的表达与检测被作为细胞活性的主要指标。此最后一步可再次利用共聚焦成像，以确定活/死聚集体之间的空间分布关系。此外，活/死聚集体的鉴定还可用于后续第3节中的细胞分选。

1. 18小时后，向含有SCFM2培养物的四孔光学底培养皿的每个孔中加入PI。PI的添加体积和孵育时间请遵循制造商的说明（例如，约每毫升培养物2 μL，20-30分钟。

5. 使用荧光激活细胞分选（FACS）方法从细胞聚集体中分离活细胞

注意：FACS 提供了一个强大的平台，可根据荧光标记的表型对细胞群体进行分选和分离。此处，FACS 用于从无活力的聚集体中分离出有活力（耐抗生素）的聚集体。

1. 使用碘化丙啶染色后，将培养物从孵育环境中取出，并转移至保温容器中送至流式细胞仪，以维持 37 °C。
2. 以最低流速检测含铜绿假单胞菌（Pa）聚集体的 SCFM2 培养基 1 mL 等分试样。
   注意：每个等分试样将包含约 15,000 个聚集体。
3. 为检测 GFP，使用 488 nm 激光照射细胞，并在 530/30 nm 处记录荧光信号高度；通过 561 nm 激光激发以观察 PI 染色，并在 610/20 nm 处记录荧光信号高度。使用 70-µm 喷嘴进行分选。
   注意：根据使用者的具体应用，分选后的聚集体可通过多种方式合并。本实验中，采用流式细胞分选（FACS）分离具有活性的 Pa 聚集体，用于后续 RNA 测序。

表1：合成囊性纤维化痰液培养基SCFM2缓冲基础所需盐、氨基酸、DNA和黏蛋白储备液的配制。

化学物质	储备浓度 (M)	终浓度 (mM)	备注
NaH2PO4	0.2	1.3
Na2HPO4	0.2	1.25
KNO3	1	0.35
K2SO4	0.25	0.27
NH4Cl		2.28	直接将固体加入缓冲基础液中
KCl		14.94	直接将固体加入缓冲基础液中
NaCl		51.85	直接将固体加入缓冲基础液中
MOPS		10	直接将固体加入缓冲基础液中
Ser	0.1	1.45
Glu HCl	0.1	1.55
Pro	0.1	1.66
Gly	0.1	1.2
Ala	0.1	1.78
Val	0.1	1.12
Met	0.1	0.63
Ile	0.1	1.12
Leu	0.1	1.61
Orn HCl	0.1	0.68
Lys HCl	0.1	2.13
Arg HCl	0.1	0.31
Trp	0.1	0.01	用 0.2 M NaOH 配制
Asp	0.1	0.83	用 0.5 M NaOH 配制
Tyr	0.1	0.8	用 1.0 M NaOH 配制
Thr	0.1	1.07
Cys HCl	0.1	0.16
Phe	0.1	0.53
His HCl H2O	0.1	0.52
鲑鱼精 DNA		0.6 mg/mL
猪黏蛋白		5 mg/nL

表2：合成囊性纤维化痰液培养基SCFM2缓冲碱基所需额外储备液的配制。

化学物质	储存浓度 (M)	终浓度 (mM)	备注
Dextrose (D-glu2cose)	1	3
L-lactic acid	1	9.3	用 NaOH 调至 pH 7.0
CaCl2*H2O	1	1.75
MgCl2*6H2O	1	0.61
FeSO4*7H2O	1 mg/mL	0.0036	每日新鲜配制
N-acetylglucosamine	0.25	0.3
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocoline (DOPC)	25 mg/mL	100 µg/mL	加入后于 37 °C 孵育至少 20 分钟

结果

图1：SCFM2培养基的制备与接种。（A）使用表1和表2中列出的盐类和氨基酸配制缓冲基础液。缓冲基础液可在4 °C下保存最多30天，但必须避光保存。（B）将黏蛋白和DNA加入一份缓冲基础液中，并在4 °C下过夜溶解。（C）将脂质及其他储备液加入过夜溶解后的溶液中，在37 °C、250 rpm振荡条件下孵育20分钟。然后用洗涤过的对数生长期细胞以OD₆₀₀ = 0.05的浓度接种SFCM2培养基。缩写：SCFM2 = 合成囊性纤维化痰液培养基。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氨基酸
丙氨酸	Acrs Organics	56-41-7
盐酸精氨酸	MP	1119-34-2
天冬酰胺	Acrs Organics	56-84-8	用 0.5 M NaOH 配制
盐酸胱氨酸	Alfa Aesar	L06328
盐酸谷氨酸	Acrs Organics	138-15-8
甘氨酸	Acrs Organics	56-40-6
盐酸组氨酸一水合物（Histidine HCl H2O）	Alfa Aesar	A17627
异亮氨酸	Acrs Organics	73-32-5
亮氨酸	Alfa Aesar	A12311
盐酸赖氨酸	Alfa Aesar	J62099
甲硫氨酸	Acrs Organics	63-68-3
盐酸鸟氨酸	Alfa Aesar	A12111
苯丙氨酸	Acrs Organics	63-91-2
脯氨酸	Alfa Aesar	A10199
丝氨酸	Alfa Aesar	A11179
苏氨酸	Acrs Organics	72-19-5
色氨酸	Acrs Organics	73-22-3	用 0.2 M NaOH 配制
酪氨酸	Alfa Aesar	A11141	用 1.0 M NaOH 配制
缬氨酸	Acrs Organics	72-18-4
抗生素
羧苄青霉素	Alfa Aesar	J6194903
当日配制的储备液
六水合氯化钙（CaCl2* 6H2O）	Fisher Chemical	C79-500
右旋葡萄糖（D-葡萄糖）	Fisher Chemical	50-99-7
1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（DOPC）	Fisher（Avanti Polar Lipids）	4235-95-4	在 37 °C 摇动 15–20 分钟以蒸发氯仿
七水合硫酸亚铁（FeSO4 * 7H2O）	Acrs Organics	7782-63-0	该储备液浓度为 1 mg/mL，必须新鲜配制
L-乳酸	Alfa Aesar	L13242	用 NaOH 将储备液 pH 调至 7
六水合氯化镁（MgCl2 * 6H2O）	Acrs Organics	7791-18-6
N-乙酰葡糖胺	TCI	A0092
已配制的固体
猪黏蛋白	Sigma	M1778-100G	紫外灭菌
鲑鱼精子 DNA	Invitrogen	15632-011
染料
碘化丙啶	Alfa Aesar	J66764MC
盐类
硫酸钾（K2SO4）	Alfa Aesar	A13975
氯化钾（KCl）	Alfa Aesar	J64189	将固体直接加入缓冲基础液中
硝酸钾（KNO3）	Acrs Organics	7757-79-1
MOPS	Alfa Aesar	A12914	将固体直接加入缓冲基础液中
氯化钠（NaCl）	Fisher Chemical	S271-500	将固体直接加入缓冲基础液中
磷酸氢二钠（Na2HPO4）	RPI	S23100-500.0
磷酸二氢钠（NaH2PO4）	RPI	S23120-500.0
氯化铵（NH4Cl）	Acrs Organics	12125-02-9	将固体直接加入缓冲基础液中
耗材
锥形管（15 mL）	Olympus plastics	28-101
锥形管（50 mL）	Olympus plastics	28-106
带通气盖的培养管	Olympus plastics	21-129
35 mm 四孔玻璃底培养皿	CellVis	NC0600518
LB 培养基（Luria-Bertani broth）	Genessee Scientific	11-118
磷酸盐缓冲液（PBS）	Fisher Bioreagents	BP2944100
移液器吸头（p200）	Olympus plastics	23-150RL
移液器吸头（p1000）	Olympus plastics	23-165RL
血清移液管（5 mL）	Olympus plastics	12-102
血清移液管（25 mL）	Olympus plastics	12-106
血清移液管（50 mL）	Olympus plastics	12-107
超纯水（无 RNA酶/DNA酶）；纳米纯水	Genessee Scientific	18-194	表 1 中溶液的配制使用纳米纯水
注射器（10 mL）	BD	794412
注射器（50 mL）	BD	309653
0.22 mm PES 注射器滤器	Olympus plastics	25-244
PS 半微量比色皿	Olympus plastics	91-408
软件
Biorender			用于制备图示
FacsDiva6.1.3	Becton Dickinson, San Jose, CA
Imaris	Bitplane		版本 9.6
Zen Black
设备
FacsAriallu	Becton Dickinson, San Jose, CA
LSM 880 共聚焦激光扫描显微镜	Zeiss