菌落形成单位法测定宿主细胞内细菌感染量

摘要

来源：Gayle, P. 等，利用细菌病原体探测细胞和生物体水平的宿主反应 。J. Vis. Exp. （2019年）。

本视频演示了一种 体外 定量技术用于确定 单核细胞增生李斯特菌 通过菌落形成单位法感染巨噬细胞。琼脂平板上的细菌菌落代表逃逸宿主防御机制并在巨噬细胞内存活的胞内细菌群体。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 感染前细胞的准备

1. 在含有10%胎牛血清（以下简称DMEM/FCS）的DMEM培养基中，使用125 mL细胞培养瓶和维持在37 °C/5% CO₂条件下的细胞培养箱，培养小鼠巨噬细胞样细胞系RAW 264.7。
2. 感染前一天，使用细胞刮刀将细胞从扩增培养瓶中刮下，并收集至15 mL带螺帽的锥形离心管中。以800 x g 离心10分钟，弃去上清液，用1 mL不含抗生素的DMEM/FCS重悬细胞沉淀，并使用血细胞计数板或自动细胞计数仪测定细胞滴度。
3. 将细胞滴度调整至2 × 10⁶ 个细胞/mL，取0.10 mL（含2 × 10⁵ 个细胞）加入48孔细胞培养板的各孔中。确保细胞悬液覆盖整个孔的表面。
   1. 在额外的孔中接种细胞，以备后续收集条件培养基使用。同时，在另外三个孔中各加入0.10 mL DMEM/FCS，作为“无细胞对照”。
4. 在37 °C/5% CO₂的细胞培养箱中过夜培养。次日，在准备好细菌接种物并可使用之前，不要将培养板从培养箱中取出。....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BHI（脑心浸液）肉汤	EMD Milipore	110493
DMEM 培养基	Gibco	11965-092
FBS - heat-inactivated	Sigma-Aldrich	F4135-500ML
LB 琼脂	Grow Cells MS	MBPE-4040
TPP 组织培养 48 孔板	MIDSCI	TP92048