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所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。
1. 感染前细胞的准备
- 在含有10%胎牛血清（以下简称DMEM/FCS）的DMEM培养基中，使用125 mL细胞培养瓶和维持在37 °C/5% CO2条件下的细胞培养箱，培养小鼠巨噬细胞样细胞系RAW 264.7。
- 感染前一天，使用细胞刮刀将细胞从扩增培养瓶中刮下，并收集至15 mL带螺帽的锥形离心管中。以800 x g 离心10分钟，弃去上清液，用1 mL不含抗生素的DMEM/FCS重悬细胞沉淀，并使用血细胞计数板或自动细胞计数仪测定细胞滴度。
- 将细胞滴度调整至2 × 106 个细胞/mL，取0.10 mL（含2 × 105 个细胞）加入48孔细胞培养板的各孔中。确保细胞悬液覆盖整个孔的表面。
- 在额外的孔中接种细胞，以备后续收集条件培养基使用。同时，在另外三个孔中各加入0.10 mL DMEM/FCS，作为“无细胞对照”。
- 在37 °C/5% CO2的细胞培养箱中过夜培养。次日，在准备好细菌接种物并可使用之前，不要将培养板从培养箱中取出。
2. 准备用于感染的 Listeria monocytogenes （Lm）
- 接种一株来自新鲜划线琼脂平板的单菌落至2 mL脑心浸液（BHI）培养基中（<2 天）的 Lm 37 °C、130 转/分钟振荡培养过夜。
- 第二天，将0.10 mL过夜培养物加入2 mL预热的BHI中，继续在37 °C振荡培养，直至光密度（OD600在0.4到0.6之间。
- 使用经验导出的换算公式确定细菌滴度的大致数值。在我们的实验室中，处于指数生长期的 Lm 在BHI中培养约为1.3 × 109 菌落形成单位（CFU）/OD600尽量减少细菌培养物在室温下的暴露时间。
- 感染前立即调整滴度至 5 x 107 CFU/mL，使用预热的DMEM/FCS作为稀释液。
3. 感染
- 迅速而精确地操作，将20 µL（1 × 106 CFU；感染复数，MOI = 5）新制备的 Lm 接种液（见上述步骤2.4）加入孔中，方法是将培养皿轻微倾斜，并小心地将移液枪头插入上层培养基中；
注意： 避免移液枪头接触孔壁。
- 轻柔吹打各孔内容物以确保充分混匀；切勿振荡或大幅倾斜培养板，以免将 Lm 扩散至孔壁。将细胞培养皿放回37 °C/5% CO2 培养箱中。
- 使用未感染孔的条件培养基作为稀释液，配制10 µg/mL的庆大霉素溶液。
- 在感染后30分钟（mpi），小心加入30 µL庆大霉素溶液（终浓度为2.5 µg/mL），并像之前一样轻柔吹打孔内液体，随后将细胞培养皿放回37 °C/5% CO2 培养箱中。
- 在感染后60分钟（mpi），收获相应孔中的样本，用于CFU检测（60 mpi时间点）或流式细胞术（FCM）分析（分别见下文第4和第5节）。
- 对于其余孔，在此后不同时间点，可按前述方法收获细胞；或在进行 Lm 释放实验时，完全移除孔内培养基，并更换为150 µL不含庆大霉素的条件培养基。
4. 胞内与外排物质的采样处理与分析 Lm 通过菌落形成单位（CFU）测定法
- 收获时，轻轻倾斜培养皿，小心移除孔中的全部培养基。向孔中加入 0.50 mL 无菌蒸馏水（dsH2O）。30 秒后，将所得的水裂解液（100）转移至 1.5 mL 微量离心管中，剧烈涡旋振荡 10 秒。
- 通过将 4.5 µL 或 50 µL 水裂解液分别加入 450 µL 的 dsH2O 中，制备 10-1 和 10-2 稀释液，并短暂涡旋以确保充分混匀。
- 取 50 µL 的 100、10-1 和/或 10-2 样品，涂布于溶菌肉汤（LB）琼脂平板上。
- 为检测释放出的 Lm （见上述步骤 3.6），吸取 10 µL 上清培养基并分为两个 5 µL 等份：向一份中加入 5 µL DMEM/FCS，向另一份中加入含 5 µg/mL 庆大霉素的 5 µL DMEM/FCS。后者作为对照，用于在后续的菌落形成单位（CFU）测定中区分细胞外 Lm （对庆大霉素敏感）与细胞内 Lm （对庆大霉素耐受）。
- 室温孵育 5 分钟后，加入 90 µL dsH2O，剧烈涡旋振荡 10 秒，取 50 µL 涂布于 LB 琼脂平板上。
- 在 37 °C 培养 2 天后，对 LB 琼脂平板上的 Lm 菌落进行计数 。