体外李斯特菌（Listeria monocytogenes）胞内及新出现胞外阶段的流式细胞术分析

摘要

来源：Gayle, P. 等，利用细菌病原体探究细胞与生物体水平的宿主应答，J. Vis. Exp. (2019)

在本视频中，我们定量检测细胞内和细胞外 单核细胞增生李斯特菌， 一种胞内致病菌，在感染培养的巨噬细胞后 体外 使用流式细胞术。

方案

1. 利用流式细胞术（FCM）对细胞内及外排的Lm进行采样处理与分析

1. 在37 °C、5% CO₂培养箱中，使用含10%胎牛血清的DMEM培养基（以下简称DMEM/FCS）和125 mL细胞培养瓶培养小鼠巨噬细胞样细胞系RAW 264.7₂调整细胞浓度至 1 × 10⁶ 个/mL⁶ 细胞/mL，并加入1 mL（1 × 10⁶ 细胞接种至6孔组织培养板的各孔中。
2. 准备 单核细胞增生李斯特菌，Lm，细菌接种物，并用对应于感染复数（MOI）为50（5 × 10）的接种物体积感染细胞⁷ 菌落形成单位（CFU）。
3. 感染后1.5小时（hpi），收集第一组孔中的培养基，加入含有500 µL 4%多聚甲醛（PFA）的1.5 mL微量离心管中，置于冰上，待所有孔处理完毕。
4. 收集细胞内物质 Lm，加入1 mL的ds H₂将液体转移至孔中，60 秒后，将所得水裂解液转移至含有 500 µL 4% PFA 的 1.5 mL 微型离心管中。剧烈涡旋振荡 10 秒，然后置于冰上，直至所有孔均处理完毕。
5. 对于其余孔，吸除培养基，更换为含 5 µg/mL 庆大霉素的 1 mL DMEM/FCS，以杀灭胞外菌 Lm 并立即将细胞放回培养箱。
6. 30 分钟后（2 hpi）移除培养基，更换为不含庆大霉素的 DMEM/FCS。
7. 在2小时和4小时（即感染后4小时和6小时）分别收集培养基和裂解液，获取第二和第三时间点的样本。
8. 离心管，10,000 x g 7 分钟后，小心去除上清液，切勿扰动沉淀。
9. 将每个沉淀重悬于50 µL 4% PFA和15 µL鬼笔环肽组成的染色液中。将离心管置于4 °C避光孵育20分钟。
10. 孵育后，向每管中加入 1 mL FACS 缓冲液，用移液器上下吹打混匀。
11. 以 10,000 x 转速离心管子 g 7 分钟后，小心去除上清液，勿扰动沉淀。
12. 将每个沉淀重悬于400 µL FACS缓冲液中，用于立即检测；若需保存以备后续分析，则重悬于200 µL FACS缓冲液和200 µL 4% PFA中。
13. 在流式细胞仪上运行样本，并分析所收集的数据。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BHI（脑心浸液）肉汤	EMD Milipore	110493
细胞筛，70 µm	VWR	10199-656
胶原酶 D	Roche	11088858001
DMEM 培养基	Gibco	11965-092
FACS 管	BD Falcon	352054
FBS — 热灭活	Sigma-Aldrich	F4135-500ML
Hanks' 平衡盐溶液	Sigma-Aldrich	H6648-6X500ML
LB 琼脂	Grow Cells MS	MBPE-4040
LIVE/DEAD 可固定黄色死细胞染色试剂盒	Life Technologies	L349S9
罗丹明鬼笔环肽	Thermo Fischer	R415
SP6800 光谱分析仪	Sony
TPP 组织培养 48 孔板	MIDSCI	TP92048
TPP 组织培养 6 孔板	MIDSCI	TP92406