使用纳米注射器通过细菌悬液感染果蝇

摘要

来源：Khalil, S. 等人全身性细菌感染与免疫防御表型 黑腹果蝇. 视频实验杂志 (2015)

本视频展示了将细菌悬液纳米注射至果蝇体腔的过程，导致细菌增殖并引发感染。果蝇的免疫反应可清除部分细菌，而另一些细菌则逃避免疫清除，在宿主体内存活并引起感染。

方案

1. 收集并准备果蝇

在所需的实验条件下饲养 Drosophila melanogaster 。饲养过程中注意避免果蝇密度过高，并确保各处理组之间的幼虫密度保持一致，因为幼虫阶段的环境条件会显著影响成虫阶段的免疫防御表型。
在羽化后0– 3天内收集实验用果蝇，并将其转移至新鲜培养基中。
将收集的果蝇置于适宜温度下（通常22 °C至28 °C之间较为合适），饲养至羽化后5–7天。
注意：此阶段足以使果蝇完成变态发育并达到性成熟，但仍处于衰老发生之前。
在感染前将所需数量的果蝇分选至另一试管中，同样需注意避免过度拥挤。
注意：本演示中仅感染雄性果蝇，但使用所述方法同样可对雌性果蝇进行感染。

2. 培养并准备细菌

至少在感染前两天制备所选细菌的主培养平板。从长期保存于-80 °C的15%甘油菌种中划线接种细菌。主培养平板可保存在4 °C，最长两周。每次均应直接从冷冻甘油菌种中划线制备主培养平板。避免将细菌在平板之间连续传代，因为反复培养传代可能导致细菌毒力减弱。
注意： 此示例使用了 普罗威登斯菌属雷特格里菌 和 大肠杆菌.
使用以下步骤制备用于注射的细菌悬液。
1. 从主平板上挑取单菌落接种于无菌培养基中，培养2 ml细菌菌液，至菌液达到稳定期（例如 37 °C过夜培养。
  注意： 两者 P. rettgeri 和 E. coli 在20 - 37 °C温度范围内，于Luria肉汤中轻度振荡培养时生长良好。
2. 当培养物进入稳定期后，从约 600 µl 培养液中轻柔地离心收集细胞在台式离心机中离心培养物（5,000 x g，3 分钟） g），弃去上清液，将细菌重悬于约 1,000 µl 中无菌磷酸盐缓冲液（PBS；137 mM 氯化钠，NaCl，2.7 mM 氯化钾，KCl，10 mM 磷酸钠，Na₂PO₄，1.8 mM 磷酸二氢钾，KH₂PO₄₂PO₄，pH = 7.4）。
3. 将重悬的细胞用无菌PBS稀释至适合所用细菌的光密度（OD），在分光光度计上测定其在600 nm处的吸光度。使用该菌液感染果蝇。
  注意： A₆₀₀ = 0.1 或 1.0 分别对应于约 10⁸ 和 10⁹普罗威登斯菌属雷特格里菌 或 大肠杆菌 每毫升。由于活菌和死菌均会对光密度产生贡献，因此重要的是在细菌进入稳定期早期即收获培养物，以避免细菌残体积累，从而防止光密度与感染时引入的活菌数量之间的关系发生扭曲。

3. 感染果蝇

注意：由于 Drosophila 的免疫反应受昼夜节律影响，因此在不同实验重复中应在每天相近的时间点进行感染操作。

使用纳米注射器
1. 准备用于感染的玻璃针。
  1. 使用微电极拉制仪拉制硼硅酸盐玻璃毛细管，制备玻璃针。
  2. 用镊子折断针尖，形成直径约50 µm的开口，以便液体排出。
2. 组装注射器。
  1. 将密封O型圈和白色垫片（较大的凹面朝外）依次套在金属推杆上。
  2. 使用带有30 G针头的注射器将矿物油注入玻璃针中。
  3. 将装有矿物油的玻璃针穿过卡盘，然后将较大的O型圈套在针的基部，距离针的钝端约1 mm。
  4. 将针滑入金属推杆，并轻轻旋紧卡盘直至固定。
  5. 从注射器中排出大部分矿物油，但需确保针内仍保留少量矿物油，作为注射器与细菌悬液之间的屏障。确保矿物油、细菌悬液内部以及两种液体之间均无气泡。
  6. 将注射器设定为所需的注射体积（介于9 nl至50 nl之间）。
3. 制备创伤对照。
  1. 通过将毛细针尖小心插入含有培养基的离心管中，并按下注射器上的“填充”按钮，将无菌PBS注入注射针内。
    注意：如果实验要求将细菌悬浮于其生长培养基中进行注射，则也可使用无菌细菌培养基作为创伤对照。但由于细菌培养基含有可刺激免疫系统或对宿主产生其他影响的成分，因此优选使用PBS等惰性载体。
  2. 在轻微的二氧化碳（CO₂）气流下麻醉所需数量的果蝇。
  3. 在果蝇腹侧前腹部进行注射，注入无菌PBS。
    注意：也可选择其他注射位点（如胸部的胸侧板），但在同一实验中必须保持注射位点一致。
  4. 将注射后的果蝇转移至装有新鲜培养基的新试管中，并将试管横放，直到所有果蝇从麻醉状态恢复，以防止果蝇粘附在食物上。
    注意：建议先注射PBS对照组果蝇，再对实验组果蝇注射细菌，以便两种处理使用同一根针。但并非总能在整个实验中使用同一根针。若需更换针头，建议记录每根针所使用的果蝇，并在统计分析中将针头编号作为实验因素加以考虑。
4. 注射细菌病原体。
  1. 排出注射器中残留的无菌培养基，并用同一根针重新吸入细菌悬液。
  2. 重复上述步骤（3.1.3），此次将步骤2.2中制备的细菌悬液注射入果蝇体内。

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材料

本文使用的材料清单
姓名	公司	目录编号
培养箱	Powers Scientific, Inc	DROS52SD
画笔
CO₂ 果蝇麻醉垫	FlyStuff	59-114
CO₂	Airgas	CD FG50
果蝇培养基
显微镜	Olympus Corporation	SZ51
聚苯乙烯果蝇培养管	VWR international	89092-720
非无菌大号棉球	Fisher brand	22-456-883
带透明盖、凸缘的培养皿；100 × 15 mm	VWR international	25384-302
LB 琼脂，Miller 配方	Difco	244520
接种环	VWR international	80094-488
Rainin Clasic 移液器（多种规格） 0.1 µl 至 2 µl， 2 µl 至 20 µl， 20 µl 至 200 µl， 100 µl 至 1000 µl	Rainin	PR-2 PR-20 PR-200 PR-1000
移液器吸头（多种规格）	VWR international	30128-376 53503-810 16466-008
LB 肉汤基础，Miller 配方	Difco	241420
一次性硼硅酸盐玻璃培养管	VWR international	47729-576
S-500 轨道摇床	VWR international	14005-830
离心机	VWR international	37001-300
PBS pH 7.4 10x	Invitrogen	70011044
SmartSpec 3000 分光光度计	Bio-Rad	170-2501
半微量比色皿	Bio-Rad	223-9955
垂直毛细管拉制仪	Kopf Needle Pipette Puller
Nanojet II 用 3.5 英寸替换玻璃毛细管	Drummond Sientific Company	3-000-203-G/X
Nanoject II	Drummond Sientific Company	3-000-204
镊子	Fine Science Tools	11255-20
10 mL 注射器	BD	309604
矿物油，白色，轻质	Macron Fine Chemicals	6358-10
1.5 mL 微量离心管；Seal Rite	USA Scientific Inc.	1615-5500

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