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一种通过脓毒针刺技术在果蝇中诱导全身性细菌感染的方法

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2025年7月8日

本文内容

摘要

来源：Khalil, S., 等. 系统性细菌感染与免疫防御表型 黑腹果蝇. 视频实验杂志 (2015)

本视频展示了一种通过将病原细菌直接注入果蝇体腔来感染Drosophila的技术。该方法可绕过上皮屏障及其他被动防御机制，从而诱导系统性感染。感染后，通过监测果蝇死亡率并进行下游检测，评估所引发的免疫反应。

方案

1. 收集并准备果蝇

  1. 在所需的实验条件下饲养黑腹果蝇（D. melanogaster）。饲养过程中注意避免果蝇过度拥挤，并确保各处理组间的幼虫密度保持一致，因为幼虫阶段的环境条件会显著影响成虫阶段的免疫防御表型。
  2. 在羽化后0至3天内收集实验用果蝇，并将其转移至新鲜培养基中。
  3. 将收集的果蝇置于适宜温度下（通常22 °C至28 °C之间较为合适），饲养至羽化后5至7天龄。
    注意：此阶段足以使果蝇完成变态发育并成为成熟成虫，但仍远早于衰老期的开始。
  4. 在感染前将所需数量的果蝇分选至单独的试管中，同样需注意避免过度拥挤。
    注意：本演示中仅感染雄性果蝇，但使用所述方法同样可对雌性果蝇进行感染。

2. 培养并制备细菌

  1. 至少在感染前2天制备所选细菌的母板。从长期保存于-80 °C的15%甘油菌种中划线接种细菌。母板可保存在4 °C下最长2周。每次均须直接从冷冻甘油菌种中划线制备母板。避免将细菌在平板之间连续传代，因反复培养传代可能导致细菌毒力减弱。
    注意： 此示例使用了 普罗威登斯菌属雷特格里菌 和 大肠杆菌.
  2. 采用以下步骤制备用于注射的细菌悬液。
    1. 从主平板上挑取单菌落接种于无菌培养基中，培养2 ml细菌菌液，至菌液达到稳定期（例如 37 °C过夜培养
      注意： 两者 P. rettgeri 和 E. coli 在20 - 37 °C条件下，于Luria肉汤中轻度振荡培养可良好生长。
    2. 当培养物达到稳定期后，取约 600 µl 培养液，在台式离心机中轻柔地沉淀细胞（5,000 × g 离心 3 分钟），弃去上清液，并将细菌重悬于约 1,000 µl 无菌磷酸盐缓冲液（PBS；137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na2PO4，1.8 mM KH2PO4，pH = 7.4。
    3. 将重悬的细胞用无菌PBS稀释至适合所用细菌的光密度（OD），该值通过分光光度计在600 nm处测得的吸光度确定。使用此菌悬液感染果蝇。
      注意： A600 = 0.1 或 1.0 分别对应于约 108 和109 Proteus rettgeri 或 E. coli 每毫升。由于活细菌和死细菌均会对光密度产生影响，因此重要的是在细菌进入稳定期早期时即进行培养物收集，以避免细菌残体积累，从而干扰光密度与感染时引入的活菌数量之间的关系。

3. 感染果蝇

注意：由于黑腹果蝇（Drosophila）的免疫反应受昼夜节律影响，因此在不同实验重复中应尽量在每天相同的时间点进行感染操作。

  1. 使用脓毒症针刺法
    1. 准备用于刺伤的针具。
      1. 将200 µl微量移液器吸头的末端加热熔化，并将一根直径0.15 mm的昆虫微细针插入熔融的塑料中。待塑料凝固，使针固定在塑料中，且约有0.5 cm长度的针尖从塑料中伸出。
    2. 建立创伤对照组。
      1. 在轻微的CO2气流下麻醉所需数量的果蝇。
      2. 用针具刺穿果蝇胸部的胸侧板，避免刺入翅和足的附着部位。如有必要，使用柔软的镊子轻轻将果蝇从微细针上取下。
        注意：也可选择其他部位进行刺伤，例如腹前部的腹外侧表面，但在同一实验中必须保持刺伤部位一致。通过腹部体壁进行刺伤通常比刺伤胸部更困难，因此较少采用。
      3. 将刺伤后的果蝇转移至装有新鲜培养基的新试管中，并将试管横放，直至所有果蝇从麻醉状态恢复，以防止果蝇粘附在培养基上。
    3. 引入细菌感染。
      1. 在轻微的CO2气流下麻醉所需数量的果蝇。
      2. 与介质对照组相同的位置刺伤每只果蝇，在刺伤每只果蝇前，先将针尖浸入步骤2.2中制备的细菌悬液中。
      3. 将刺伤后的果蝇转移至装有新鲜培养基的新试管中，并将试管横放，直至所有果蝇从麻醉状态恢复，以防止果蝇粘附在培养基上。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
培养箱Powers Scientific, IncDROS52SD
画笔
CO2 果蝇麻醉垫FlyStuff59-114
CO2 AirgasCD FG50
果蝇培养基混合物
6 oz 方底瓶，聚丙烯材质Genesee Scientific32-130
非无菌超大棉球Fisher brand22-456-882
显微镜Olympus CorporationSZ51
聚苯乙烯果蝇培养管VWR international89092-720
非无菌大号棉球Fisher brand22-456-883
2L 锥形瓶VWR international89000-370
带透明盖、凸缘的培养皿；100 × 15 mmVWR international25384-302
LB 琼脂，Miller 配方Difco244520
接种环VWR international80094-488
Rainin Clasic 移液器（多种规格）
0.1 µl 至 2 µl，
2 µl 至 20 µl，
20 µl 至 200 µl，
100 µl 至 1000 µl		RaininPR-2
PR-20
PR-200
PR-1000
移液器吸头（多种规格）VWR international30128-376
53503-810
16466-008
LB 肉汤基础，Miller 配方Difco241420
一次性培养管，硼硅酸盐玻璃材质VWR international47729-576
S-500 轨道摇床VWR international14005-830
离心机VWR international37001-300
PBS 缓冲液，pH 7.4，10 倍浓缩液Invitrogen70011044
SmartSpec 3000 分光光度计Bio-Rad170-2501
半微量比色皿Bio-Rad223-9955
镊子Fine Science Tools11255-20
矿物油，白色，轻质Macron Fine Chemicals6358-10
Minutein 固定针Fine Science Tools26002-10
1.5 mL 微量离心管；Seal Rite 品牌USA Scientific Inc.1615-5500

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