测量 E. coli 细菌载量在 黑腹果蝇 随后 E. coli 感染

摘要

来源：Khalil, S., 等 系统性细菌感染与免疫防御表型 黑腹果蝇 视频实验杂志  (2015)

在本视频中，我们演示一种用于测量的技巧 E. coli 注射后的细菌载量 E. coli 进入胸腔 黑腹果蝇

方案

1. 检测感染后细菌载量

1. 测定细菌载量。
   1. 在注射后规定的时间点，将每只果蝇放入预冷的微量离心管中，置于冰上。
   2. 向每根试管中加入 250 µl PBS，使用研杵或珠磨仪充分匀浆果蝇组织。
   3. 将匀浆液接种至 LB 琼脂平板上，可采用螺旋接种仪或梯度稀释法。
      1. 若采用梯度稀释法接种，将每只果蝇的匀浆液转移至 96 孔板的第一行孔中。
      2. 向其余各行的每个孔中加入 90 µl PBS。
      3. 使用多通道移液器，从含有果蝇匀浆液的第一行孔中吸取 10 µl，加入第二行孔中。
      4. 上下吹打至少 10 次以充分混匀，然后吸取 10 µl 转移至第三行孔。依此方法依次进行后续各行的稀释。
      5. 从最末行（即细菌悬液稀释度最高）开始，使用多通道移液器从每孔中吸取 10 µl，滴加至 LB 平板上，注意使样品形成彼此不接触的独立斑点。按稀释度从高到低的顺序依次完成所有孔的取样与点样。
      6. 将平板置于室温下，直至所有斑点完全渗入 LB 琼脂中。
         注意：建议在使用前将 LB 平板在室温下干燥数天，以确保液体迅速被吸收，减少样品斑点间意外接触的可能性。
   4. 将平板过夜培养（O/N），注意避免过度生长，以保持菌落小而独立。
      注意：根据所用细菌培养基和培养温度的不同，源自果蝇内源性肠道微生物群的菌落可能最终在平板上显现。然而，在 37 °C 的 LB 琼脂上，大多数用于致病性感染的实验菌株的生长速度远快于肠道微生物群。
   5. 当实验菌株形成可见菌落（通常为 8–12 小时）但果蝇肠道微生物群菌落尚未出现（约 36 小时）时，及时将平板从培养箱中取出。  对于生长缓慢的实验菌株，可在 LB 琼脂中添加选择性抗生素以消除肠道微生物群形成的菌落。
   6. 计数每个匀浆样品的菌落数。
      1. 对于螺旋接种平板，使用自动菌落计数器计数菌落，该仪器可根据平板上菌落的数量和位置估算每毫升匀浆液中的细菌数量。
         注意：当细菌浓度在每毫升 5 × 10² 至 5 × 10⁴ 个细菌范围内时，螺旋接种计数结果最为准确。
      2. 对于点样平板，手动计数每只果蝇在菌落数为 30–300 的稀释度孔中的菌落数，并据此计算原始匀浆液中每毫升的细菌数量。
2. 数据分析。
   1. 若细菌载量数据不符合正态分布，可对数据进行转换以使其更接近正态分布，或采用非参数统计方法（例如，Mann-Whitney U 检验）进行分析。可使用 Box-Cox 分析确定最优转换方式；自然对数或以 10 为底的对数转换通常效果良好。
   2. 若数据近似正态分布，且仅比较两种处理组，则采用 t 检验判断两组处理是否导致平均细菌载量存在显著差异。若存在多个实验变量或其他潜在预测因子，则采用方差分析（ANOVA）确定哪些因素是细菌载量的显著预测因子。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
带透明盖、凸起边缘的培养皿；100 × 15 mm	VWR international	25384-302
LB 琼脂，Miller 型	Difco	244520
接种环	VWR international	80094-488
1.5 mL 微型离心管；Seal Rite	USA Scientific Inc.	1615-5500
电动研钵；Talboys 实验室搅拌器	Troemner	103
Talboys 高通量均质仪	OPS Diagnostics	930145
5/32'' 研磨珠	OPS Diagnostics	GBSS 156-5000-01
Vortex Genie 涡旋振荡器	Scientific industries inc.	G560
多通道移液器（10 µL–300 µL）	Sartorius	730360
WASP2 Whitley 自动螺旋涂布仪	Microbiology International
ProtoCOL 自动菌落计数器 / 平板计数器 / 平板读取仪	Microbiology International
培养箱	Powers Scientific, Inc	DROS52SD