通过荧光显微镜检测炎症小体的活化

摘要

来源：den Hartigh, A. B. 等，小鼠骨髓来源巨噬细胞中炎性小体激活与细胞焦亡的检测。J. Vis. Exp. (2018)

本视频展示了一种利用荧光报告探针检测巨噬细胞中NLRP3炎症小体活化的方法。通过钾离子载体和甘氨酸处理细胞，以诱导炎症小体的组装及caspase-1的活化。荧光报告探针可显示活化的caspase-1，同时使用荧光染料对细胞核进行染色以实现可视化。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 骨髓的采集

1. 无菌条件下从小鼠体内取出股骨和胫骨，并使用无菌器械清理骨骼。将清理后的骨骼置于含杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）+ 5 mM N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸（HEPES）+ 0.2 mg/mL L-谷氨酰胺 + 0.05 mM 2-巯基乙醇 + 50 mg/mL 硫酸庆大霉素 + 10,000 U/mL 青霉素/链霉素 + 10% 胎牛血清（FBS，DMEM-10 完全培养基）的溶液中，将试管置于冰上孵育 15 分钟。
2. 使用剪刀切除近端和远端的球状关节。将连接有装满培养基的 10 mL 注射器的 25 G 针头插入骨骼空腔内，用 DMEM-10 完全培养基冲洗骨髓。通过轻柔吹打培养基使任何细胞团块重悬。
3. 以 300 × g 离心细胞 10 分钟，并使用血细胞计数板计数细胞数量。此时可选择使用 90% FBS + 10% 二甲基亚砜（DMSO）冻存细胞，或将细胞接种于 15 cm 培养皿中，利用 L929 条件培养基诱导巨噬细胞分化（步骤 2.1）。

2. 骨髓来源巨噬细胞的分化

1. 使用预热的分化培养基（21 mL DMEM-10 完全培养基和 9 mL L929 细胞条件培养基，具体方法参见 Swanson et al.），将骨髓细胞接种于一个 15 cm 的非组织培养处理的培养皿中（1.2–1.5 × 10⁷ 个细胞）。将培养皿置于 37 °C、5% 二氧化碳（CO₂ ）环境中培养 7 天。在第 3 或第 4 天向培养皿中额外添加 30 mL 分化培养基。
   注意：切勿使用组织培养处理的培养皿，否则巨噬细胞将难以脱离和收获。
2. 收集巨噬细胞时，先用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗培养皿，然后加入 20 mL 冷的 PBS + 1 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）。将培养皿置于 4 °C 孵育 10 分钟。通过用移液器将 PBS + EDTA 液在细胞表面反复吹打来收获细胞，并用 10 mL PBS 冲洗培养皿。将两次冲洗液合并至两个 15 mL 圆底离心管中。
3. 以 300 × g 离心 10 分钟，弃上清，将细胞重悬于 10 mL 酚红-free DMEM + 5 mM HEPES + 0.2 mg/mL L-谷氨酰胺 + 0.05 mM 2-巯基乙醇 + 5% 胎牛血清（FBS）（即 DMEM-5 培养基）中，使用血细胞计数板或库尔特计数器进行细胞计数。计数过程中保持细胞置于冰上。
4. 将巨噬细胞以 2 × 10⁵ 个细胞/mL 的密度接种于组织培养包被的培养板中。进行显微镜实验时，将 1 mL 细胞悬液接种于 24 孔板中的盖玻片上。进行乳酸脱氢酶（LDH）释放检测时，将 100 µL 细胞悬液接种于 96 孔板中。进行 LDH 检测时，接种 9 个孔（3 个孔不作处理，3 个孔设为 100% 裂解对照，3 个孔用于实验刺激处理）。
5. 将 96 孔板以 300 × g 离心 5 分钟，以确保细胞均匀分布于各孔底部。
6. 开始诱导处理前，将培养板在 37 °C、5% CO₂ 条件下过夜孵育。

3. 引物设计

1. 将培养基更换为含有100 ng/mL脂多糖（LPS）的新鲜培养基（DMEM-5）（24孔板每孔500 μL，96孔板每孔50 μL）。
   注意： LPS存在多种结构变异，会影响其刺激TLR4介导的启动能力。建议使用来自多个供应商的 Salmonella minnesota R595（Re）型LPS。
2. 在37 °C、5% CO₂条件下孵育3小时。

4. 使用尼日利亚菌素激活NLRP3炎症小体并用FAM-YVAD-FMK标记

1. 移除培养基，并加入含有5 μM 尼日霉素（nigericin）和5 mM 甘氨酸的290 μL DMEM-5培养基。添加甘氨酸以减少caspase-1激活过程中发生的细胞裂解。在37 °C、5% CO₂条件下孵育60分钟。使用野生型和caspase-1缺陷型巨噬细胞，以确保观察到的标记特异性针对caspase-1。
2. 在孵育的最后45分钟内，加入10 μL按制造商说明配制的30倍浓缩FAM-YVAD-FMK。
3. 60分钟后，移除培养基，并用1 mL冷PBS洗涤细胞三次，每次5分钟。
4. 向每孔加入250 μL 2%多聚甲醛，在冰上避光（用铝箔包裹）孵育30分钟。
5. 在最后5分钟时，加入4 μL 0.2 mM远红荧光核酸染料以标记细胞核。也可使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）或其他染料标记DNA。
6. 用1 mL冷PBS洗涤细胞三次，然后将盖玻片用7 μL抗荧光淬灭封片剂封固于载玻片上。待封片剂过夜硬化后，用指甲油将盖玻片密封固定于载玻片。
7. 通过共聚焦显微镜观察巨噬细胞。FAM-YVAD-FMK的激发/发射波长为492/520 nm，远红荧光核酸染料为642/661 nm。务必设置显微镜参数，确保未处理细胞在488通道中无背景染色；否则将检测到FAM-YVAD-FMK的背景信号，而非真实的活化caspase-1。

5. 共聚焦显微镜对标记巨噬细胞的成像

注意：待盖玻片在室温下静置过夜并用指甲油封固于显微镜载玻片后，即可观察染色后的细胞。此处描述的是使用共聚焦显微镜进行成像的方法。也可通过标准荧光显微镜观察细胞。

1. 将未处理对照组细胞的载玻片置于显微镜载物台上，并将显微镜聚焦于细胞。
2. 利用显微镜的查找表（LUT）设置，调节偏移量，使未处理细胞中无明显的FAM-YVAD-FMK染色信号。此步骤也可使用caspase-1缺陷型巨噬细胞进行。
   注意：实验中使用的每个通道均需调整偏移量，但FAM-YVAD-FMK通道及荧光抗体通道的偏移量设置尤为关键，而DNA通道的偏移量相对不敏感。一旦设定偏移量，在后续实验过程中不得再进行调整。
3. 更换为尼日利亚菌素（nigericin）处理的样本载玻片。寻找一个同时包含FAM-YVAD-FMK染色阳性与阴性细胞的视野。将FAM-YVAD-FMK通道的成像平面调整至阳性信号最强的层面，通常为炎性小体焦点中心所在的成像平面。
4. 调节增益，使具有浓缩细胞核的细胞中可见清晰的焦点信号。在完成增益和偏移量设置后，整个成像过程中保持这些参数不变。
   注意：判断细胞是否发生焦亡的一个简便方法是观察细胞核形态。激活caspase-1的细胞表现为细胞核呈圆形且浓缩，而未激活caspase-1的细胞仍可见核仁，其核形态与未处理细胞相似。
5. 以100倍总放大倍数随机选取5个视野采集图像，每个图像通常包含约40个细胞。对每个样本重复此过程。
6. 使用图像分析软件统计每张图像中的细胞总数，再统计其中FAM-YVAD-FMK染色阳性的细胞数量。将caspase-1的激活水平表示为FAM-YVAD-FMK阳性细胞所占的百分比。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
E-MEM	ATCC	30-2003	用于培养 L929 细胞
NCRC clone 929 (L929)	ATCC	CCL-1
固定/透化试剂盒	BD Biosciences	554714	包含固定液、透化液和洗涤缓冲液。 专有配方，含有 4.2% 甲醛
甘氨酸	Biorad	161-0718
FAM-YVAD-FMK	Immunocytochemistry Technologies	98
杜氏磷酸盐缓冲液（无钙、无镁）	Invitrogen	14190144
胎牛血清，经鉴定，源自美国	Invitrogen	26140079	在 55°C 下热灭活 50 分钟
庆大霉素	Invitrogen	15750060
ProLong Gold 封片剂	Invitrogen	p36934	专有配方，固化型封片剂，固化后折射率为 1.46
HEPES（超纯）	Invitrogen	11344041
L-谷氨酰胺	Invitrogen	21051024
青霉素-链霉素	Invitrogen	15140122
C57BL/6J 小鼠	Jackson Laboratory	664
Caspase-1/11-/- 小鼠	Jackson Laboratory	16621
Leica SP8X 共聚焦显微镜	Leica
来自 Salmonella minnesota R595 (Re) 的超纯 LPS	List Biologicals	434
β-巯基乙醇	Millipore-Sigma	M6250-10ML
DMSO	Millipore-Sigma	D2650-5X10ML
EDTA	Millipore-Sigma	E5391