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通过荧光显微镜检测炎症小体的活化

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2025年7月8日

本文内容

摘要

来源:den Hartigh, A. B. 小鼠骨髓来源巨噬细胞中炎性小体激活与细胞焦亡的检测J. Vis. Exp. (2018)

本视频展示了一种利用荧光报告探针检测巨噬细胞中NLRP3炎症小体活化的方法。通过钾离子载体和甘氨酸处理细胞,以诱导炎症小体的组装及caspase-1的活化。荧光报告探针可显示活化的caspase-1,同时使用荧光染料对细胞核进行染色以实现可视化。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 骨髓的采集

  1. 无菌条件下从小鼠体内取出股骨和胫骨,并使用无菌器械清理骨骼。将清理后的骨骼置于含杜氏改良伊格尔培养基(DMEM)+ 5 mM N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸(HEPES)+ 0.2 mg/mL L-谷氨酰胺 + 0.05 mM 2-巯基乙醇 + 50 mg/mL 硫酸庆大霉素 + 10,000 U/mL 青霉素/链霉素 + 10% 胎牛血清(FBS,DMEM-10 完全培养基)的溶液中,将试管置于冰上孵育 15 分钟。
  2. 使用剪刀切除近端和远端的球状关节。将连接有装满培养基的 10 mL 注射器的 25 G 针头插入骨骼空腔内,用 DMEM-10 完全培养基冲洗骨髓。通过轻柔吹打培养基使任何细胞团块重悬。
  3. 以 300 × g 离心细胞 10 分钟,并使用血细胞计数板计数细胞数量。此时可选择使用 90% FBS + 10% 二甲基亚砜(DMSO)冻存细胞,或将细胞接种于 15 cm 培养皿中,利用 L929 条件培养基诱导巨噬细胞分化(步骤 2.1)。

2. 骨髓来源巨噬细胞的分化

  1. 使用预热的分化培养基(21 mL DMEM-10 完全培养基和 9 mL L929 细胞条件培养基,具体方法参见 Swanson et al.),将骨髓细胞接种于一个 15 cm 的非组织培养处理的培养皿中(1.2–1.5 × 107 个细胞)。将培养皿置于 37 °C、5% 二氧化碳(CO2 )环境中培养 7 天。在第 3 或第 4 天向培养皿中额外添加 30 mL 分化培养基。
    注意:切勿使用组织培养处理的培养皿,否则巨噬细胞将难以脱离和收获。
  2. 收集巨噬细胞时,先用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗培养皿,然后加入 20 mL 冷的 PBS + 1 mM 乙二胺四乙酸(EDTA)。将培养皿置于 4 °C 孵育 10 分钟。通过用移液器将 PBS + EDTA 液在细胞表面反复吹打来收获细胞,并用 10 mL PBS 冲洗培养皿。将两次冲洗液合并至两个 15 mL 圆底离心管中。
  3. 以 300 × g 离心 10 分钟,弃上清,将细胞重悬于 10 mL 酚红-free DMEM + 5 mM HEPES + 0.2 mg/mL L-谷氨酰胺 + 0.05 mM 2-巯基乙醇 + 5% 胎牛血清(FBS)(即 DMEM-5 培养基)中,使用血细胞计数板或库尔特计数器进行细胞计数。计数过程中保持细胞置于冰上。
  4. 将巨噬细胞以 2 × 105 个细胞/mL 的密度接种于组织培养包被的培养板中。进行显微镜实验时,将 1 mL 细胞悬液接种于 24 孔板中的盖玻片上。进行乳酸脱氢酶(LDH)释放检测时,将 100 µL 细胞悬液接种于 96 孔板中。进行 LDH 检测时,接种 9 个孔(3 个孔不作处理,3 个孔设为 100% 裂解对照,3 个孔用于实验刺激处理)。
  5. 将 96 孔板以 300 × g 离心 5 分钟,以确保细胞均匀分布于各孔底部。
  6. 开始诱导处理前,将培养板在 37 °C、5% CO2 条件下过夜孵育。

3. 引物设计

  1. 将培养基更换为含有100 ng/mL脂多糖(LPS)的新鲜培养基(DMEM-5)(24孔板每孔500 μL,96孔板每孔50 μL)。
    注意: LPS存在多种结构变异,会影响其刺激TLR4介导的启动能力。建议使用来自多个供应商的 Salmonella minnesota R595(Re)型LPS。
  2. 在37 °C、5% CO2条件下孵育3小时。

4. 使用尼日利亚菌素激活NLRP3炎症小体并用FAM-YVAD-FMK标记

  1. 移除培养基,并加入含有5 μM 尼日霉素(nigericin)和5 mM 甘氨酸的290 μL DMEM-5培养基。添加甘氨酸以减少caspase-1激活过程中发生的细胞裂解。在37 °C、5% CO2条件下孵育60分钟。使用野生型和caspase-1缺陷型巨噬细胞,以确保观察到的标记特异性针对caspase-1。
  2. 在孵育的最后45分钟内,加入10 μL按制造商说明配制的30倍浓缩FAM-YVAD-FMK。
  3. 60分钟后,移除培养基,并用1 mL冷PBS洗涤细胞三次,每次5分钟。
  4. 向每孔加入250 μL 2%多聚甲醛,在冰上避光(用铝箔包裹)孵育30分钟。
  5. 在最后5分钟时,加入4 μL 0.2 mM远红荧光核酸染料以标记细胞核。也可使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)或其他染料标记DNA。
  6. 用1 mL冷PBS洗涤细胞三次,然后将盖玻片用7 μL抗荧光淬灭封片剂封固于载玻片上。待封片剂过夜硬化后,用指甲油将盖玻片密封固定于载玻片。
  7. 通过共聚焦显微镜观察巨噬细胞。FAM-YVAD-FMK的激发/发射波长为492/520 nm,远红荧光核酸染料为642/661 nm。务必设置显微镜参数,确保未处理细胞在488通道中无背景染色;否则将检测到FAM-YVAD-FMK的背景信号,而非真实的活化caspase-1。

5. 共聚焦显微镜对标记巨噬细胞的成像

注意:待盖玻片在室温下静置过夜并用指甲油封固于显微镜载玻片后,即可观察染色后的细胞。此处描述的是使用共聚焦显微镜进行成像的方法。也可通过标准荧光显微镜观察细胞。

  1. 将未处理对照组细胞的载玻片置于显微镜载物台上,并将显微镜聚焦于细胞。
  2. 利用显微镜的查找表(LUT)设置,调节偏移量,使未处理细胞中无明显的FAM-YVAD-FMK染色信号。此步骤也可使用caspase-1缺陷型巨噬细胞进行。
    注意:实验中使用的每个通道均需调整偏移量,但FAM-YVAD-FMK通道及荧光抗体通道的偏移量设置尤为关键,而DNA通道的偏移量相对不敏感。一旦设定偏移量,在后续实验过程中不得再进行调整。
  3. 更换为尼日利亚菌素(nigericin)处理的样本载玻片。寻找一个同时包含FAM-YVAD-FMK染色阳性与阴性细胞的视野。将FAM-YVAD-FMK通道的成像平面调整至阳性信号最强的层面,通常为炎性小体焦点中心所在的成像平面。
  4. 调节增益,使具有浓缩细胞核的细胞中可见清晰的焦点信号。在完成增益和偏移量设置后,整个成像过程中保持这些参数不变。
    注意:判断细胞是否发生焦亡的一个简便方法是观察细胞核形态。激活caspase-1的细胞表现为细胞核呈圆形且浓缩,而未激活caspase-1的细胞仍可见核仁,其核形态与未处理细胞相似。
  5. 以100倍总放大倍数随机选取5个视野采集图像,每个图像通常包含约40个细胞。对每个样本重复此过程。
  6. 使用图像分析软件统计每张图像中的细胞总数,再统计其中FAM-YVAD-FMK染色阳性的细胞数量。将caspase-1的激活水平表示为FAM-YVAD-FMK阳性细胞所占的百分比。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
E-MEMATCC30-2003用于培养 L929 细胞
NCRC clone 929 (L929) ATCCCCL-1
固定/透化试剂盒BD Biosciences554714包含固定液、透化液和洗涤缓冲液。 专有配方,含有 4.2% 甲醛
甘氨酸Biorad161-0718
FAM-YVAD-FMKImmunocytochemistry Technologies98
杜氏磷酸盐缓冲液(无钙、无镁)Invitrogen14190144
胎牛血清,经鉴定,源自美国Invitrogen26140079在 55°C 下热灭活 50 分钟
庆大霉素Invitrogen15750060
ProLong Gold 封片剂Invitrogenp36934专有配方,固化型封片剂,固化后折射率为 1.46
HEPES(超纯)Invitrogen11344041
L-谷氨酰胺Invitrogen21051024
青霉素-链霉素Invitrogen15140122
C57BL/6J 小鼠Jackson Laboratory664
Caspase-1/11-/- 小鼠Jackson Laboratory16621
Leica SP8X 共聚焦显微镜Leica
来自 Salmonella minnesota R595 (Re) 的超纯 LPSList Biologicals434
β-巯基乙醇Millipore-SigmaM6250-10ML
DMSOMillipore-SigmaD2650-5X10ML
EDTAMillipore-SigmaE5391

标签

Caspase 1 NLRP3