通过荧光显微镜检测炎性小体激活

所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审查。

1. 骨髓的收获

1. 无菌地从小鼠身上取出股骨和胫骨，并使用无菌器械清洁骨骼。将清洁后的骨头放入 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM） + 5 mM N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸 （HEPES） + 0.2 mg/mL L-谷氨酰胺 + 0.05 mM 2-巯基乙醇 + 50 mg/mL 硫酸庆大霉素 + 10,000 U/mL 青霉素/链霉素 + 10% 胎牛血清（FBS，DMEM-10 完全），并将试管在冰上孵育 15 分钟。
2. 用剪刀去除近端和远端球形关节。将连接在装满培养基的 10 mL 注射器上的 25 G 针头插入骨骼的空腔中。使用 DMEM-10 complete 冲洗骨髓。轻轻上下移液培养基，重悬任何团块。
3. 将细胞以 300 x g 离心 10 分钟，并使用血细胞计数器计数细胞数。此时，使用 90% FBS + 10% 二甲基亚砜 （DMSO） 冷冻细胞，或将细胞接种在 15 cm 培养皿中，以使用 L929 条件培养基分化巨噬细胞（步骤 2.1）。

2. 骨髓来源巨噬细胞的分化

1. 使用预热的分化培养基（21 mL DMEM-10 完全培养基和 9 mL L929 细胞条件培养基，如 Swanson 等人所述），将骨髓细胞放入 15 cm 非组织培养处理的培养皿中（1.2-1.5 x 10⁷ 个细胞）。将板在 37 °C 和 5% 二氧化碳或 CO₂ 下孵育 7 天。在第 3 天或第 4 天向板中额外添加 30 mL 分化培养基。
   注意:重要的是不要使用经组织培养处理的板，因为巨噬细胞将难以分离和收获。
2. 要收集巨噬细胞，请用磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 洗涤板，并加入 20 mL 冷 PBS + 1 mM 乙二胺四乙酸 （EDTA）。将板在 4 °C 下孵育 10 分钟。通过在细胞上移液 PBS + EDTA 并用 10 mL PBS 洗涤板来收获细胞。将两种洗涤液合并到两个 15 mL 锥形管中。
3. 将细胞以 300 x g 离心 10 分钟，然后将细胞重悬于 10 mL 不含酚红的 DMEM + 5 mM HEPES + 0.2 mg/mL L-谷氨酰胺 + 0.05 mM 2-巯基乙醇 + 5% FBS （DMEM-5） 中，并使用血细胞计数器或 Coulter 计数器对细胞进行计数。在计数过程中将细胞保持在冰上。
4. 将巨噬细胞以 2 x 10⁵ 个细胞/mL 的浓度接种在组织培养包被的板中。对于显微镜实验，在 24 孔板的盖玻片上接种 1 mL 细胞。对于乳酸脱氢酶 （LDH） 释放测定，在 96 孔板中接种 100 μL 细胞。对于 LDH 测定，接种 9 个孔（3 个孔未处理，3 个孔具有 100% 裂解对照，3 个孔用于实验刺激）。
5. 以 300 x g 的速度离心 96 孔板 5 分钟，以确保细胞在孔中均匀分布。
在
6. 开始引发过程之前，将板在 37 °C + 5% CO₂ 下孵育过夜。

3. 启动

1. 用含有 100 ng/mL 脂多糖或 LPS（24 孔板为 500 μL，96 孔板为 50 μL）的新鲜培养基 （DMEM-5） 替换培养基><。 注意:LPS 中存在多种结构变异，这会影响刺激 TLR4 介导的启动的能力。来自明尼苏达沙门氏菌 R595 （Re） 的 LPS 可从多家供应商处获得，并推荐使用。
2. 将板在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育 3 小时。

4. 用黑菌素激活 NLRP3 炎性小体并用 FAM-YVAD-FMK 标记

1. 去除培养基，用 290 μL 含有 5 μM 尼日利亚菌素和 5 mM 甘氨酸的 DMEM-5 替换。添加甘氨酸以减少 caspase-1 激活过程中发生的细胞裂解量。在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育 60 分钟。使用野生型和 caspase-1 缺陷型巨噬细胞，以确保观察到的标记对 caspase-1 具有特异性。
2. 在最后 45 分钟内，加入 10 μL 30x FAM-YVAD-FMK，根据制造商的说明制备。
3. 60 分钟后，取出培养基并用 1 mL 冷 PBS 洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟。
4. 向每个孔中加入 250 μL 2% 多聚甲醛，并在覆盖有铝箔的冰上孵育 30 分钟。
5. 在最后 5 分钟内，加入 4 μL 0.2 mM 远红外荧光核酸染料以标记细胞核。4'，6-二脒基-2-苯基吲哚 （DAPI） 或其他染料也可用于标记 DNA。
6. 用 1 mL 冷 PBS 洗涤细胞 3 次，并使用 7 μL 抗褪色封固剂将盖玻片固定在显微镜载玻片上。让封固剂硬化过夜，然后使用指甲油将盖玻片密封到显微镜载玻片上。
7. 通过共聚焦显微镜对巨噬细胞进行成像。FAM-YVAD-FMK 的 Ex/Em 为 492/520nm，远红外荧光核酸染料的 Ex/Em 为 642/661。确保设置显微镜，使未处理的细胞在 488 通道中不显示任何背景染色。否则，将检测到背景 FAM-YVAD-FMK 染色，而不是实际的活性 caspase-1。

5. 用共聚焦显微镜对标记的巨噬细胞进行成像

注意:在盖玻片固化过夜并用指甲油密封到显微镜载玻片上后，可以查看染色的细胞。这里描述了使用共聚焦显微镜的成像。细胞也可以通过标准荧光显微镜观察。

1. 将载玻片和未处理的对照细胞放在显微镜载物台上，并将显微镜聚焦在细胞上。
2. 使用显微镜查找表 （LUT） 设置，调整偏移量，以便在未处理的细胞中没有阳性 FAM-YVAD-FMK 染色。这个过程也可以使用 caspase-1 缺陷型巨噬细胞进行。
   注意:必须针对实验中使用的每个通道调整偏移量，但设置 FAM-YVAD-FMK 通道和荧光抗体通道的正确偏移量最为关键。DNA 通道的偏移量不太重要。设置偏移量后，请勿在实验的其余部分调整此设置。
3. 将载玻片切换到尼日利亚菌素处理的样品。查找包含 FAM-YVAD-FMK 染色阳性和阴性细胞的字段。将 FAM-YVAD-FMK 通道的成像平面调整到具有最高阳性染色强度的平面。这通常是炎性小体焦点中心成像的平面。
4. 调整增益，使集焦点在具有浓缩细胞核的细胞中可见。设置增益和偏移后，将这些设置留给成像会话的其余部分。
   注意:确定细胞是否焦亡的一种简单方法是查看细胞核形态。具有活性 caspase-1 的细胞具有圆形和浓缩的细胞核，而核仁在未激活 caspase-1 的细胞中可见，并且核形态与未处理细胞相似。
5. 以 100 倍总放大倍率收集 5 个随机选择字段的图像。这通常会导致每张图像大约有 40 个单元格。对每个样品重复此过程。
6. 使用图像分析软件计算每张图像中的细胞数。然后计算 FAM-YVAD-FMK 染色阳性的细胞数。将 caspase-1 激活水平表示为 FAM-YVAD-FMK 阳性细胞的百分比。