通过荧光显微镜检测炎症小体的活化

摘要

来源：den Hartigh, A. B. 等，小鼠骨髓来源巨噬细胞中炎性小体激活与细胞焦亡的检测。J. Vis. Exp. (2018)

本视频展示了一种利用荧光报告探针检测巨噬细胞中NLRP3炎症小体活化的方法。通过钾离子载体和甘氨酸处理细胞，以诱导炎症小体的组装及caspase-1的活化。荧光报告探针可显示活化的caspase-1，同时使用荧光染料对细胞核进行染色以实现可视化。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 骨髓的采集

1. 无菌条件下从小鼠体内取出股骨和胫骨，并使用无菌器械清理骨骼。将清理后的骨骼置于含杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）+ 5 mM N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸（HEPES）+ 0.2 mg/mL L-谷氨酰胺 + 0.05 mM 2-巯基乙醇 + 50 mg/mL 硫酸庆大霉素 + 10,000 U/mL 青霉素/链霉素 + 10% 胎牛血清（FBS，DMEM-10 完全培养基）的溶液中，将试管置于冰上孵育 15 分钟。
2. 使用剪刀切除近端和远端的球状关节。将连接有装满培养基的 10 mL 注射器的 25 G 针头插入骨骼空腔内，用 DMEM-10 完全培养基冲洗骨髓。通过轻柔吹打培养基使任何细胞团块重悬。
3. 以 300 × g 离心细胞 10 分钟，并使用血细胞计数板计数细胞数量。此时可选择使用 90% FBS + 10% 二甲基亚砜（DMSO）冻存细胞，或将细胞接种于 15 cm 培养皿中，利用 L929 条件培养基诱导巨噬细胞分化（步骤 2.1）。

2. 骨髓来源巨噬细胞的分化

1. 使用预热的分化培养基（21 mL DMEM-10 完全培养基和 ....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
E-MEM	ATCC	30-2003	用于培养 L929 细胞
NCRC clone 929 (L929)	ATCC	CCL-1
固定/透化试剂盒	BD Biosciences	554714	包含固定液、透化液和洗涤缓冲液。 专有配方，含有 4.2% 甲醛
甘氨酸	Biorad	161-0718
FAM-YVAD-FMK	Immunocytochemistry Technologies	98
杜氏磷酸盐缓冲液（无钙、无镁）	Invitrogen	14190144
胎牛血清，经鉴定，源自美国	Invitrogen	26140079	在 55°C 下热灭活 50 分钟
庆大霉素	Invitrogen	15750060
ProLong Gold 封片剂	Invitrogen	p36934	专有配方，固化型封片剂，固化后折射率为 1.46
HEPES（超纯）	Invitrogen	11344041
L-谷氨酰胺	Invitrogen	21051024
青霉素-链霉素	Invitrogen	15140122
C57BL/6J 小鼠	Jackson Laboratory	664
Caspase-1/11-/- 小鼠	Jackson Laboratory	16621
Leica SP8X 共聚焦显微镜	Leica
来自 Salmonella minnesota R595 (Re) 的超纯 LPS	List Biologicals	434
β-巯基乙醇	Millipore-Sigma	M6250-10ML
DMSO	Millipore-Sigma	D2650-5X10ML
EDTA	Millipore-Sigma	E5391