一种研究巨噬细胞中炎性小体复合物形成的体外技术

摘要

来源:den Hartigh， A. B.， et al.检测小鼠骨髓来源的巨噬细胞中的炎性小体活化和焦亡细胞死亡。J. Vis. Exp.（2018 年）。

该视频演示了一种通过免疫荧光研究原代巨噬细胞中 NOD 样受体家族含 pyrin 结构域 3 （NLRP3） 炎性小体形成的技术。巨噬细胞首先用细菌脂多糖 （LPS） 引发，以上调 NLRP3 蛋白表达。将巨噬细胞暴露于黑合菌素（一种钾离子载体）会导致 NLRP3 激活和炎性小体的形成，这可以通过免疫荧光观察到。

方案

所有涉及动物模型的程序均已由当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审查。

1. 骨髓来源的巨噬细胞的分化

1. 使用预热的分化培养基（21 mL DMEM-10 完全培养基和 9 mL L929 细胞条件培养基，如 Swanson 等人所述），将骨髓细胞放入 15 cm 非组织培养处理的培养皿中（1.2-1.5 x 10⁷ 个细胞）。将板在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育 7 天。在第 3 天或 4.
   向板中额外添加 30 mL 分化培养基 注意:重要的是不要使用经组织培养处理的板，因为巨噬细胞将难以分离和收获。
2. 要收集巨噬细胞，请用磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 洗涤板，并加入 20 mL 冷 PBS + 1 mM 乙二胺四乙酸 （EDTA）。将板在 4 °C 下孵育 10 分钟。通过在细胞上移液 PBS + EDTA 并用 10 mL PBS 洗涤板来收获细胞。将两种洗涤液合并到两个 15 mL 锥形管中。
3. 将细胞以 300 x g 离心 10 分钟，然后将细胞重悬于 10 mL 不含酚红的 DMEM + 5 mM HEPES + 0.2 mg/mL L-谷氨酰胺 + 0.05 mM 2-巯基乙醇 + 5% FBS （DMEM-5） 中，并使用血细胞计数器或 Coulter 计数器对细胞进行计数。在计数过程中将细胞保持在冰上。
4. 将巨噬细胞以 2 x 10⁵ 个细胞/mL 的浓度接种在组织培养包被的板中。对于显微镜实验，在 24 孔板的盖玻片上接种 1 mL 细胞。对于 LDH 释放测定，在 96 孔板中接种 100 μL 细胞。对于 LDH 测定，接种 9 个孔（3 个孔未处理，3 个孔具有 100% 裂解对照，3 个孔用于实验刺激）。
5. 以 300 x g 的速度离心 96 孔板 5 分钟，以确保细胞在孔中均匀分布。
在
6. 开始引发过程之前，将板在 37 °C + 5% CO₂ 下孵育过夜。

2. 启动

1. 用含有 100 ng/mL LPS（24 孔板为 500 μL，96 孔板为 50 μL）的新鲜培养基 （DMEM-5） 替换培养基><。 注意:LPS 中存在多种结构变异，这会影响刺激 TLR4 介导的启动的能力。来自明尼苏达沙门氏菌 R595 （Re） 的 LPS 可从多家供应商处获得，并推荐使用。
2. 将板在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育 3 小时。

3. 用黑菌素激活 NLRP3 炎性小体

1. 去除培养基，用 290 μL 含有 5 μM 尼日利亚菌素和 5 mM 甘氨酸的 DMEM-5 替换。添加甘氨酸以减少 caspase-1 激活过程中发生的细胞裂解量。在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育 60 分钟。使用野生型和 caspase-1 缺陷型巨噬细胞，以确保观察到的标记对 caspase-1 具有特异性。
2. 60 分钟后，取出培养基并用 1 mL 冷 PBS 洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟。

4. 抗体染色

注意:用抗体标记细胞以检测 ASC，接种、启动并将细胞暴露于与上一节相同的尼日利亚菌素中。之后的处理如下:

1. 用 1 mL 冷 PBS 洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟。加入 250 μL 固定和透化溶液。将细胞在冰上孵育，并盖上 30 分钟。
2. 用 1 mL 洗涤缓冲液洗涤巨噬细胞 3 次，每次 5 分钟。
3. 加入 250 μL 在洗涤缓冲液中以 1:500 稀释的 ASC 一抗，并在冰上孵育 1 小时。包括一个不接收任何一抗但仅接收二抗的盖玻片。此盖玻片将在显微镜设置期间用于设置正确的偏移量。
4. 用 1 mL 洗涤缓冲液洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟。
5. 加入 250 μL 在洗涤缓冲液中以 1:500 稀释的二抗（荧光染料偶联的山羊抗小鼠），并在冰上孵育 1 小时。在孵育的最后 5 分钟内加入 4 μL 0.2 mM 远红外荧光核酸染色剂以标记细胞核。
6. 用 1 mL 冷洗涤缓冲液洗涤细胞 3 次，并使用 7 μL 抗褪色封固剂将盖玻片固定在显微镜载玻片上。让封固剂硬化过夜，然后使用透明指甲油将盖玻片密封到显微镜载玻片上。
7. 通过共聚焦显微镜对巨噬细胞进行成像。二抗的 Ex/Em 为 555/580 nm，远红外荧光核酸染色剂的 Ex/Em 为 642/661。

材料