一种用于研究巨噬细胞中炎性小体复合物形成的体外技术

摘要

来源：den Hartigh, A. B.，等。小鼠骨髓来源巨噬细胞中炎性小体激活与焦亡细胞死亡的检测。J. Vis. Exp. (2018)。

本视频展示了一种用于研究原代巨噬细胞中NOD样受体家族含吡啶结构域3（NLRP3）炎性小体形成的实验技术 通过 免疫荧光。首先用细菌脂多糖（LPS）对巨噬细胞进行预处理，以上调NLRP3蛋白表达。随后将巨噬细胞暴露于尼日利亚菌素（nigericin）——一种钾离子载体——从而激活NLRP3并形成炎性小体，这些结构可通过免疫荧光观察到 通过 免疫荧光

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 骨髓来源巨噬细胞的分化

1. 使用预热的分化培养基（21 mL DMEM-10 完全培养基和 9 mL L929 细胞条件培养基，具体配制方法见 Swanson et al. 的描述），将骨髓细胞接种于一个 15 cm 未经组织培养处理的培养皿中（细胞数量为 1.2–1.5 × 10⁷ 个）。将培养皿置于 37 °C、5% CO₂ 条件下培养 7 天。在第 3 或第 4 天向培养皿中额外添加 30 mL 分化培养基。
   注意：切勿使用组织培养处理过的培养皿，否则巨噬细胞将难以脱离和收集。
2. 收集巨噬细胞时，先用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗培养皿，然后加入 20 mL 冷的 PBS + 1 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）。将培养皿置于 4 °C 孵育 10 分钟。用移液器将 PBS + EDTA 液在细胞表面反复吹打，使细胞脱落，并用 10 mL PBS 冲洗培养皿以收集残留细胞。将两次洗涤液合并至两个 15 mL 圆底离心管中。
3. 以 300 × g 离心 10 分钟，弃上清后将细胞重悬于 10 mL 酚红-free DMEM + 5 mM HEPES + 0.2 mg/mL L-谷氨酰胺 + 0.05 mM 2-巯基乙醇 + 5% 胎牛血清（FBS）（即 DMEM-5 培养基）中，使用血细胞计数板或库尔特计数器对细胞进行计数。计数过程中保持细胞置于冰上。
4. 将巨噬细胞以 2 × 10⁵ 个/mL 的密度接种于组织培养包被的培养板中。进行显微镜实验时，将 1 mL 细胞悬液接种至 24 孔板中的盖玻片上；进行乳酸脱氢酶（LDH）释放实验时，将 100 µL 细胞悬液接种至 96 孔板中。对于 LDH 检测，需接种 9 个孔（3 个孔为空白对照，3 个孔设为 100% 裂解对照，3 个孔用于实验刺激处理）。
5. 将 96 孔板以 300 × g 离心 5 分钟，以确保细胞均匀分布于各孔底部。
6. 在开始启动处理前，将培养板于 37 °C、5% CO₂ 条件下过夜孵育。

2. 引物配制

1. 将培养基更换为含有 100 ng/mL LPS 的新鲜培养基（DMEM-5）（24 孔板每孔 500 μL，96 孔板每孔 50 μL）。
   注意：LPS 存在多种结构变异，会影响其刺激 TLR4 介导的启动能力。Salmonella minnesota R595 (Re) 来源的 LPS 可从多家供应商获得，推荐使用。
2. 在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 3 小时。

3. 使用尼日利亚菌素激活NLRP3炎症小体

1. 吸除培养基，加入含有 5 μM 尼日利亚菌素和 5 mM 甘氨酸的 290 μL DMEM-5 培养基。添加甘氨酸以减少在caspase-1激活过程中发生的细胞裂解。在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下孵育 60 分钟。使用野生型和caspase-1缺陷型巨噬细胞，以确保观察到的标记特异性针对caspase-1。
2. 孵育 60 分钟后，吸除培养基，并用 1 mL 冷 PBS 洗涤细胞三次，每次 5 分钟。

4. 抗体染色

注意：为了使用抗体标记细胞以检测ASC，需将细胞接种、预处理并用尼日利亚菌素处理，操作步骤与前一节相同。后续处理步骤如下：

1. 用 1 mL 冷 PBS 每次 5 分钟，洗涤细胞三次。加入 250 μL 固定和透化溶液。将细胞置于冰上孵育，并避光孵育 30 分钟。
2. 用 1 mL 洗涤缓冲液每次 5 分钟，洗涤巨噬细胞三次。
3. 加入 250 μL 用洗涤缓冲液按 1:500 稀释的抗 ASC 一抗，冰上孵育 1 小时。设置一个不加一抗、仅加二抗的盖玻片作为对照，该盖玻片将在显微镜调试时用于设定正确的偏移值。
4. 用 1 mL 洗涤缓冲液每次 5 分钟，洗涤细胞三次。
5. 加入 250 μL 用洗涤缓冲液按 1:500 稀释的二抗（荧光染料标记的山羊抗小鼠抗体），冰上孵育 1 小时。在孵育的最后 5 分钟加入 4 μL 0.2 mM 的远红荧光核酸染料以标记细胞核。
6. 用 1 mL 冷洗涤缓冲液洗涤细胞三次，然后将盖玻片置于载玻片上，每片使用 7 μL 抗荧光淬灭封片剂。待封片剂过夜固化后，用透明指甲油将盖玻片密封固定于载玻片上。
7. 使用共聚焦显微镜观察巨噬细胞。二抗的激发/发射波长为 555/580 nm，远红荧光核酸染料为 642/661 nm。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
E-MEM	ATCC	30-2003	用于培养 L929 细胞
NCRC clone 929 (L929)	ATCC	CCL-1
固定/透化试剂盒	BD Biosciences	554714	包含固定液、透化液和洗涤缓冲液。专有配方，含 4.2% 甲醛
甘氨酸	Biorad	161-0718
DMEM，高糖，不含谷氨酰胺	Invitrogen	11960044
DMEM，高糖，不含谷氨酰胺，不含酚红	Invitrogen	31053028
Dulbecco 磷酸盐缓冲液，不含钙、镁	Invitrogen	14190144
胎牛血清，经鉴定，美国来源	Invitrogen	26140079	在 55°C 下热灭活 50 分钟
庆大霉素	Invitrogen	15750060
ProLong Gold 封片剂	Invitrogen	p36934	专有配方，固化封片介质，固化后折射率为 1.46
山羊抗小鼠 ALEXA555	Invitrogen	A-21422
HEPES（超纯）	Invitrogen	11344041
L-谷氨酰胺	Invitrogen	21051024
青霉素-链霉素	Invitrogen	15140122
TO-PRO-3 碘化物	Invitrogen	T3605	远红荧光核酸染料
C57BL/6J 小鼠	Jackson Laboratory	664
Leica SP8X 共聚焦显微镜	Leica
来自 Salmonella minnesota R595 (Re) 的超纯 LPS	List Biologicals	434
抗 ASC 单克隆抗体 2EI-7	Millipore-Sigma	04-417
β-巯基乙醇	Millipore-Sigma	M6250-10ML
DMSO	Millipore-Sigma	D2650-5X10ML
EDTA	Millipore-Sigma	E5391