一种乳酸脱氢酶释放检测法用于检测尼日尔霉素暴露后巨噬细胞的死亡

摘要

来源：den Hartigh, A.B. 等，小鼠骨髓来源巨噬细胞中炎性小体激活与细胞焦亡的检测。J. Vis. Exp. (2018)

本视频演示了乳酸脱氢酶检测法，用于检测炎性小体介导的巨噬细胞死亡。巨噬细胞首先暴露于脂多糖以进行预处理，随后暴露于尼日尔菌素，以诱导炎性小体相关的细胞死亡，细胞死亡程度通过乳酸脱氢酶检测法来确定。

方案

1. 乳酸脱氢酶释放实验

注意：进行LDH释放实验时，将细胞接种于96孔板中。引物处理后不要移除培养基。

1. 将贴壁巨噬细胞孔中的培养基更换为新鲜培养基（DMEM-5：10 mL 无酚红DMEM + 5 mM HEPES + 0.2 mg/mL L-谷氨酰胺 + 0.05 mM 2-巯基乙醇 + 5% 胎牛血清），并加入终浓度为100 ng/mL的LPS（24孔板每孔500 μL，96孔板每孔50 μL）。
   注意：LPS存在多种结构变异，会影响其激活TLR4介导的启动能力。推荐使用来自Salmonella minnesota R595（Re）的LPS。
2. 在37 °C、5% CO₂条件下孵育3小时。
3. 向实验孔中加入50 μL含10 μM尼日利亚菌素的DMEM-5，向自发性裂解对照孔和100%裂解对照孔中各加入50 μL DMEM-5。在37 °C、5% CO₂条件下孵育60分钟。
4. 在孵育开始后30分钟，向100%裂解对照孔中加入10 μL 10倍浓度裂解缓冲液，向其余孔中加入10 μL DMEM-5。在此期间，从冰箱中取出一管底物混合物（1.5 mL冻干底物）和一份检测缓冲液（约12 mL），避光置于室温下解冻。
   注意：底物混合物中含有四氮唑盐（碘硝基四氮唑紫），可被还原为红色甲臜产物。
5. 完成总共60分钟的孵育后，在10 °C下以500 × g离心5分钟。吸取50 μL上清液转移至透明平底板中。在此期间，将12 mL检测缓冲液加入底物混合物管中，混匀后室温避光孵育5分钟，备用。
6. 每孔加入50 μL底物溶液，在避光条件下孵育30分钟。设置仅含培养基的孔作为空白对照。孵育15分钟后检查读板信号，确保信号不超过酶标仪的检测上限。
7. 孵育30分钟后，每孔加入50 μL终止液（1 M乙酸），使用酶标仪测定OD₄₉₀值。
8. 使用以下公式计算细胞裂解百分比：
   % 细胞毒性 = ((实验组 - 自发性裂解组)/(最大裂解组 - 自发性裂解组)) × 100
   实验组：尼日利亚菌素处理的细胞；自发性裂解组：未处理细胞；最大裂解组：加入裂解缓冲液的细胞。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Cytotox96 非放射性细胞毒性检测试剂盒	Fisher Scientific	PR-G1780	包含底物混合液和检测缓冲液；专有配方。终止液为 1 M 乙酸
DMEM，高糖，无谷氨酰胺，无酚红	Invitrogen	31053028
Dulbecco 磷酸盐缓冲液（无钙、无镁）	Invitrogen	14190144
胎牛血清，经鉴定合格，美国来源	Invitrogen	26140079	在 55°C 下热灭活 50 分钟
庆大霉素	Invitrogen	15750060
来自 Salmonella minnesota R595 (Re) 的超纯脂多糖	List Biologicals	434
Spectramax M3 多功能微孔板读板仪	Molecular Devices	5000414
L-谷氨酰胺	Invitrogen	21051024