预标记中性粒细胞中中性粒细胞胞外诱捕网的诱导与可视化

摘要

来源：Arends, E. J. 等，一种用于评估和定量中性粒细胞胞外诱捕网形成的高通量检测方法 J. Vis. Exp. (2019)

本视频展示了利用含有抗中性粒细胞胞质抗体的患者血清，在预标记的中性粒细胞中诱导并可视化中性粒细胞胞外陷阱（NETs）的方法。此外，通过使用不可穿透细胞膜的DNA染料结合荧光显微镜，可实现对NETs的可视化观察。

方案

所有涉及人类参与者的操作均按照机构、国家和国际的人类福利指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审查。

1. 健康中性粒细胞的分离

1. 从健康供者处采集20 mL外周血，分装于两支10 mL乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管中。
2. 将10 mL血液放入无菌50 mL离心管中，加入磷酸盐缓冲液（PBS）至终体积32.5 mL。
3. 加入密度梯度液（例如.，Ficoll-泛影葡胺）置于细胞下方。
   1. 用10 mL移液管和移液控制器吸取14 mL密度梯度液。
   2. 将移液管置于50 mL离心管底部。
   3. 将移液控制器从移液管上取下，依靠重力使密度梯度液流出，直至毛细作用达到最大（剩余1-2 mL），此过程不使用电机。
   4. 用拇指按住移液管顶部，防止密度梯度在移除移液管时泄漏，然后取出移液管。
4. 将管子以 912 x 重力加速度离心 20 分钟 g 以及在室温（RT）下无加速或制动。     
   注意： 红细胞（RBC）和中性粒细胞密度较高，位于50 mL离心管底部。外周血单个核细胞（PBMCs）在密度梯度液上方形成白色环状层。经PBS稀释的血浆位于PBMCs层上方。如有需要，....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
无菌水 H2O	B. Braun, Melsungen, Germany	12604052
胎牛血清（FBS）	Bodinco, Alkmaar, 荷兰		高浓度使用可能影响中性粒细胞胞外诱捕网（NET）的形成
Ficoll 5.7% - 胺基三甲酸 9%，密度 1.077 g/mL	LUMC, Leiden, 荷兰	97902861
免疫荧光共聚焦显微镜	Image Xpress Micro Confocal (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, 美国)
中和用 PBS (10x)	Gibco, Paisley, 英国	70011-036
青霉素/链霉素（p/s）	Gibco, Paisley, 英国	15070063
无酚红 RPMI 1640 培养基 (1x)	Gibco, Paisley, 英国	11835-063	酚红可能干扰免疫荧光信号
磷酸盐缓冲液（PBS）	B. Braun, Melsungen, Germany	174628062
PKH26 2 µM 红色荧光细胞连接剂	Sigma Aldrich, Saint-Louis, MO, 美国	PKH26GL-1KT	PKH 是专利保护的荧光染料，是一种以发现者 Paul Karl Horan 命名的细胞标记技术
科学多维图像分析软件	ImageJ, Research Services Branch, 国立精神卫生研究所, 贝塞斯达, 马里兰州, 美国
RPMI 1640 培养基 (1x)	Gibco, Paisley, 英国	52400-025
Sytox Green 5 mM 不可渗透性 DNA 染料	Gibco, Paisley, 英国	57020
台盼蓝染液 0.4%	Sigma Aldrich, 德国	17942E
96 孔黑色平底组织培养处理板	Falcon, NY, 美国	353219