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所有涉及人类参与者的操作均按照机构、国家和国际的人类福利指南进行，并已通过当地机构审查委员会的审查。
1. 健康中性粒细胞的分离
- 从健康供者处采集20 mL外周血，分装于两支10 mL乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管中。
- 将10 mL血液放入无菌50 mL离心管中，加入磷酸盐缓冲液（PBS）至终体积32.5 mL。
- 加入密度梯度液（例如.，Ficoll-泛影葡胺）置于细胞下方。
- 用10 mL移液管和移液控制器吸取14 mL密度梯度液。
- 将移液管置于50 mL离心管底部。
- 将移液控制器从移液管上取下，依靠重力使密度梯度液流出，直至毛细作用达到最大（剩余1-2 mL），此过程不使用电机。
- 用拇指按住移液管顶部，防止密度梯度在移除移液管时泄漏，然后取出移液管。
- 将管子以 912 x 重力加速度离心 20 分钟 g 以及在室温（RT）下无加速或制动。
注意： 红细胞（RBC）和中性粒细胞密度较高，位于50 mL离心管底部。外周血单个核细胞（PBMCs）在密度梯度液上方形成白色环状层。经PBS稀释的血浆位于PBMCs层上方。如有需要，可通过将白色环状层转移至新的50 mL离心管，并使用磷酸盐缓冲液（PBS）进行额外洗涤步骤，以分离PBMCs。
- 先小心移取含有 PBMC 的白色环状层，随后移除 PBS 稀释的血浆，最后尽可能去除密度梯度层。
- 为从中性粒细胞/红细胞混合物中分离中性粒细胞，使用冷的无菌蒸馏水裂解红细胞。
- 从冰箱中取出一瓶冷藏的无菌蒸馏水和一瓶10倍浓缩的PBS溶液。
- 此步骤需迅速操作。在沉淀上方直接加入36 mL冷的无菌蒸馏水，轻轻混匀一次。20秒后加入4 mL 10×PBS，以制成等渗溶液，再次轻轻混匀一次。
- 739 × g 离心 5 分钟 g 以及 4 °C（用于去除红细胞）。中性粒细胞将位于白色沉淀中。
- 小心弃去上清液。重复步骤1.6.2，并确保沉淀充分悬浮。
- 离心 5 分钟，328 x g g 和 4 °C。
- 小心吸除上清液，将沉淀重悬于 5 mL PBS 中。计数中性粒细胞并置于冰上保存。
注意： 1管血液（10 mL）预期可获得约1500万至7500万个中性粒细胞。
2. 中性粒细胞的红色荧光细胞标记
- 在15 mL离心管中，用2 mL PBS制备含有1000万至2000万中性粒细胞的悬浮液。
- 配制2 mL PBS溶液，加入4 µL的2 µM红色荧光细胞连接剂（参见 材料表) 加入另一个15 mL离心管中，轻轻加入中性粒细胞悬液并小心混匀。
- 在37 °C避光孵育恰好25分钟，以用红色荧光细胞连接剂标记中性粒细胞。
- 通过加入含有10%热灭活胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培养基终止标记反应 室温下定容至15 mL，轻轻混匀一次。若已形成沉淀，请确保将其充分重悬。
- 离心 5 分钟，328 x g g 和 RT。
- 移除上清液，将沉淀物重悬于5 mL不含酚红的RPMI 1640培养基中，培养基中含2% FBS和10%青霉素/链霉素（P/S），于室温下进行。计数中性粒细胞。
注意： 红色荧光细胞标记后可能出现50%的细胞损失。
3. 诱导中性粒细胞胞外诱捕网的形成
- 在不含酚红的 RPMI 1640 培养基（含 2% FBS 和 10% P/S）中制备浓度为 0.42 × 106 个细胞/mL 的细胞悬液。
- 将 37,500 个中性粒细胞溶于 90 µL 悬液中，每孔加入至黑色 96 孔平底板中。
- 每孔加入 10 µL 所选刺激物（例如患者血清），每个样本设三个复孔，使孔内终浓度为 10%。每次实验均需设置阴性对照（培养基），同样设三个复孔。
- 在 37 °C 避光条件下孵育所需时间，可选择 30 分钟至 2、4 或 6 小时。建议孵育 4 小时。
- 计算需加入 25 µL 浓度为 5 µM 的不可渗透 DNA 染料（见 材料表）以使孔内终浓度达到 1 µM 所需的体积。如有必要，用含 2% FBS 和 10% P/S 的 RPMI 1640 培养基预先稀释，配制成 5 µM 的工作液。
- 在孵育结束前 15 分钟，加入 25 µL 浓度为 5 µM 的不可渗透 DNA 染料。继续在 37 °C 避光孵育 15 分钟。
- 小心移除上清液（约 125 µL），如需保存可留用。每孔加入 100 µL 4% 多聚甲醛（PFA）。避光保存，并立即进入步骤 4。
4. 中性粒细胞胞外诱捕网（NET）的三维高内涵、高分辨率免疫荧光共聚焦显微镜可视化
- 通过点击“采集设置”来配置免疫荧光共聚焦显微镜的参数。
- 点击 配置 选项卡。
- 选择物镜和相机。选用10X Apo Lambda物镜，并设置采集模式为60 µm针孔的共聚焦模式。
- 点击 板 ，选择96孔塑料板。选择需要成像的位点，并设定固定的位点数量。填写3列和3行，无重叠（0 µm），覆盖每个孔总面积的45%。
- 点击 采集。选择 启用基于激光的聚焦。如有需要，选择 采集Z序列/时间序列 。
- 点击 位点自动聚焦。
- 点击 聚焦于板底 | 按底部厚度偏移。对于用于初始定位样本的孔，选择第一个采集的孔；对于位点自动聚焦，选择所有位点。
- 点击 波长。
- 波长数量选择2。透射光（TL）明场校正精细度选择2。
- 对于波长1，选择Texas Red。
- 在自动聚焦选项中，选择带Z偏移的激光，后激光偏移为1.1 µm。使用Z栈，自定义范围为200-10。
- 对于波长2，选择异硫氰酸荧光素（FITC）。
- 在自动聚焦选项中，选择相对于波长1（w1）Z偏移为0 µm的激光。使用Z栈，自定义范围为200-10。
- 在采集选项中，选择Z序列和2D最大投影图像。在采集选项中，选择 明场校正 | 关闭。
- 选择 Z序列。选择步数：10。选择步长：3 μm（总范围为27 µm）。
- 将样品板放入免疫荧光共聚焦显微镜中。
- 点击 运行 选项卡。
- 填写板名称和描述，并选择存储位置。
- 选择需要采集的孔。
- 设置Texas Red和FITC的曝光时间。
- 点击 采集板 以开始采集，每块板的采集时间约为1小时。
5. NET 形成的分析
- 使用专为科学多维图像分析设计的图像处理程序（参见 材料表）分析NET的形成。
- 将获取的图像数据转移至独立的硬盘驱动器。
- 选择颜色叠加工具。
- 选择 w1，并选择硬盘中存储数据的文件夹。
- 选择 w2，并选择硬盘中存储数据的文件夹。
注意： 使用标准宏，该宏在文件名中使用 w1 为Texas Red图像添加红色，使用 w2 为FITC图像添加绿色。
- 选择分析宏。
- 选择 w1，并选择阈值（强度阈值），通常为10；选择所需的像素值（大小阈值，例如100）。
- 选择 w2，并选择阈值（强度阈值），通常为10；选择所需的像素值（大小阈值，例如500）。
- 选择电子表格文件的保存路径，运行分析，随后保存日志文件。
- 在电子表格中分析数据。