从人源性中性粒细胞中分离脂质的双相分离法

摘要

来源：Brogden, G., 等. 研究中性粒细胞中脂质改变及其随后形成中性粒细胞胞外诱捕网的方法. J. Vis. Exp. (2017)

本视频展示了使用甲醇和氯仿双相溶剂系统从人中性粒细胞中分离脂质的方法。

方案

1. 人源性中性粒细胞的脂质分离与分析

1. 取出中性粒细胞并置于冰上。
2. 在冰上，用移液器将中性粒细胞（存在于甲醇和氯仿溶液中）转移至带有聚四氟乙烯（PTFE）密封垫的15 mL螺口玻璃管中，并通过振荡1分钟进行匀浆。使用玻璃管可防止脂质结合到塑料表面；使用PTFE盖子可避免橡胶/塑料带来的污染。
3. 加入2 mL甲醇，1分钟后加入1 mL氯仿，再次振荡1分钟。
4. 在室温下以50 rpm转速旋转玻璃管30分钟。
5. 将溶液在7 °C、1,952 x g 条件下离心10分钟，以沉淀蛋白质组分。
6. 小心地将上清液倾入新的15 mL螺口玻璃管中，保留含蛋白质的沉淀物。将沉淀物于-20 °C保存，用于后续定量分析。
7. 加入1 mL氯仿，等待1分钟后，加入1 mL双蒸水，然后将装有样品的螺口玻璃管颠倒混匀30秒。
8. 在7 °C、1,952 x g 条件下离心10分钟，弃去上层液体，直至但不包括乳白色中间层。
9. 如有需要，可重复步骤1.1.8进行额外的纯化步骤。
10. 在60 °C下使用真空浓缩仪干燥样品，并于-20 °C保存至使用前。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10 µl 注射器	Hamilton	701 NR 10 µl
26G 套管针	Braun	4657683
氯仿	Carl Roth	7331.1
甲醇	Carl Roth	7342.1
水	Carl Roth	3255.1	无内毒素