一种通过乳酸脱氢酶释放检测法检测巨噬细胞中Cryptococcus neoformans感染的方法

摘要

来源：Ball, B.，等。基于无标记定量蛋白质组学的工作流程用于发现驱动型宿主-病原体相互作用。J. Vis. Exp. (2020)

在本视频中，我们演示了一种用于评估细胞毒性的检测方法 新型隐球菌，一种致病性真菌，在巨噬细胞中的感染。细胞毒性通过巨噬细胞裂解后胞质乳酸脱氢酶的释放来确定 新型隐球菌 感染

方案

1. 感染的验证

注意：可通过细胞毒性检测来评估感染效率。以下方案将重点介绍使用一种细胞毒性检测试剂来测定乳酸脱氢酶（LDH）的释放。也可使用其他细胞毒性检测试剂

1. 巨噬细胞感染 C. neoformans 的制备
   1. 真菌细胞的制备
      1. 使用甘油保存菌种，在酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YPD）琼脂平板上划线接种野生型 C. neoformans 菌株（H99），以分离单菌落。
      2. 在37 °C静置培养箱中培养过夜16小时。
      3. 挑选一个野生型 C. neoformans 菌株的单菌落，接种于5 mL YPD液体培养基中，装入10 mL松盖试管中。设置四重复。
      4. 在37 °C、200 rpm振荡培养箱中培养过夜16小时。
      5. 次日，将每份过夜培养物按1:100比例转接至3 mL YPD液体培养基中进行亚培养。
      6. 测定真菌培养物的光密度（OD_600nm）值，以确定其是否处于对数中期。根据分光光度计的不同，C. neoformans 野生型菌株通常在YPD培养基中培养6至8小时后达到对数中期，OD_600nm值一般在1.0至1.5之间。
      7. 当细胞达到对数中期时，取10 µL真菌细胞悬液至洁净的1.5 mL微量离心管中，用无菌1×磷酸盐缓冲液（PBS）稀释1:100，使用血细胞计数板计数细胞数量。
      8. 将细胞在1,500 x g 条件下离心10分钟，轻轻用无菌室温PBS洗涤沉淀，共洗涤三次。
      9. 将细胞重悬于不含抗生素的细胞培养基中，调整浓度至1.2 x 10⁸ 个细胞/mL。
   2. 巨噬细胞的制备
      1. 观察6孔板中各孔，确保细胞融合度达到70–80%。或者，也可通过计数使每孔巨噬细胞数量约为1.2 x 10⁶ 个。
      2. 在进行细胞培养操作前，将含抗生素的培养基预热至37 °C。确保细胞培养操作前工作环境已消毒。使用光学显微镜观察细胞，确保其贴壁良好且状态健康。
      3. 使用移液管或真空抽吸装置移除培养皿中的培养基。
      4. 向60 × 15 mm培养皿中轻柔加入5–7 mL无菌室温PBS（磷酸盐缓冲液）。
      5. 轻柔倾斜培养皿以清洗贴壁细胞。
   3. C. neoformans 与巨噬细胞的共培养
      1. 向含巨噬细胞的4个孔中各加入1 mL重悬的 C. neoformans 细胞。
         注意：实验开始前需预先计算所需培养板数量。向空孔中加入1 mL不含抗生素的培养基。
      2. 将细胞在37 °C、5% CO₂ 条件下培养3小时。
      3. 使用移液管或真空抽吸装置移除培养板中的培养基。
      4. 向每孔中轻柔加入1 mL无菌室温PBS。
      5. 轻柔倾斜培养板，以洗去未贴附或未被吞噬的胞外 C. neoformans 细胞。
      6. 向6孔板的每孔中加入1 mL不含抗生素的培养基。
      7. 将细胞在37 °C、5% CO₂ 条件下继续培养。
   4. 在选定的时间点（例如1、3、6、12和24小时），收集上清液，按照试剂盒说明书测定乳酸脱氢酶（LDH）释放量。
   5. 在同一时间点，裂解未感染的巨噬细胞，以测定最大细胞毒性值。
   6. 按以下公式计算细胞毒性：
      

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100 mM Tris-HCl, pH 8.5	赛默飞世尔科技	BP152-1	4°C 保存
60 x 15 mm 培养皿，Nunclon Delta	赛默飞世尔科技	174888
6 孔细胞培养板	赛默飞世尔科技	140675
锥形离心管（15 mL）	赛默飞世尔科技	05-539-12
Countess II 全自动细胞计数仪	赛默飞世尔科技	AMQAX1000	非必需，可使用血细胞计数板作为替代方法。
CytoTox 96 非放射性细胞毒性检测试剂盒	Promega	G1780
DMEM，高糖，含 GlutaMAX 补充物	赛默飞世尔科技	10566016
胎牛血清（FBS）	赛默飞世尔科技	12483020	在 60°C 下孵育 30 分钟进行热灭活。分装为 50 mL 每份，快速冷冻。使用前解冻
血细胞计数板	VWR	15170-208
HEPES	Sigma Aldrich	H3375	配制 40 mM HEPES/8 M 尿素的大量储备液，快速冷冻后于 -20°C 保存至使用。每次使用后丢弃（避免反复冻融）。
L-谷氨酰胺	赛默飞世尔科技	25030081	可分装后冷冻保存。使用前解冻。
微量离心机	Eppendorf	13864457
青霉素:链霉素 10k/10k	VWR	CA12001-692	可分装后冷冻保存。使用前解冻。
磷酸盐缓冲液	VWR	CA12001-676	无需购买。也可自行配制，但使用前必须进行无菌过滤。
移液管，一次性血清移液管（10 mL）	赛默飞世尔科技	13-678-11E
移液管，一次性血清移液管（25 mL）Basix	赛默飞世尔科技	14955235
胰蛋白酶/赖氨酰内肽酶蛋白酶混合物，质谱级	Pierce	A40007	于 -20 °C 保存。
尿素	Sigma Aldrich	U1250-1KG	配制 40 mM HEPES/8 M 尿素的大量储备液，快速冷冻后于 -20 °C 保存至使用。每次使用后丢弃（避免反复冻融）。
酵母提取物蛋白胨葡萄糖肉汤	BD Difco	BM20