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检测巨噬细胞新型隐球菌感染的乳酸脱氢酶释放试验

2025年7月8日

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

来源:Ball， B. 等人 用于发现驱动的宿主-病原体相互作用的无标记定量蛋白质组学工作流程。J. Vis. Exp.（2020 年）

在本视频中，我们演示了一种细胞毒性测定法，以评估巨噬细胞中的新型隐球菌（一种致病真菌）感染。细胞毒性由新型隐球菌感染引起的巨噬细胞裂解引起的细胞质乳酸脱氢酶的释放来确定。

方案

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1. 验证感染

注意:使用细胞毒性测定，可以测量感染熟练度。以下方案将重点介绍细胞毒性产物在测量 LDH（乳酸脱氢酶）释放中的应用。也可以使用其他细胞毒性产品

  1. 巨噬细胞新型隐球菌感染的制备
    1. 真菌细胞的制备
      1. 使用甘油原液，将野生型新型隐球菌菌株 （H99） 划线到酵母提取物蛋白胨葡萄糖 （YPD） 琼脂平板上，以分离单个菌落。
      2. 在静态培养箱中于 37 °C 孵育过夜 16 小时。
      3. 选择野生型新型隐球菌菌株的单个菌落，并在松散盖的 10 mL 试管中的 5 mL YPD 肉汤中培养。一式四份执行。
      4. 在 37 °C 下在振荡培养箱中以 200 rpm 孵育过夜 16 小时。
      5. 第二天，将每个过夜培养物以 1:100 稀释液传代培养到 3 mL YPD 肉汤中。
      6. 测量真菌培养物的光密度 （OD600nm） 值以确定对数中期。根据分光光度计，新型隐球菌野生型菌株通常在 YPD 中孵育 6 至 8 小时后达到对数中期，一般 OD600nm 值范围为 1.0 至 1.5。
      7. 一旦细胞达到对数中期，....

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材料

<表格border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"> 本文使用的材料清单 姓名 公司 目录编号 评论 100 毫米 Tris-HCl，pH 值 8.5 Fisher Scientific 公司 BP152-1型 保持在 4°C 60 x 15 mm 培养皿，Nunclon Delta 赛默飞世尔科技 174888 6 孔细胞培养板 赛默飞世尔科技 140675 锥形猎鹰管 （15 mL） Fisher Scientific 公司 05-539-12 Countess II 全自动细胞计数仪 赛默飞世尔科技 AMQAX1000 非必需，血细胞计数器可用作替代。 CytoTox 96 非放射性细胞毒性检测 普罗梅加 G1780 系列 DMEM、高葡萄糖、GlutaMAX 添加剂 赛默飞世尔科技 10566016 胎牛血清 （FBS） 赛默飞世尔科技 12483020 在 60°C 下孵育 30 分钟，使其热灭活。准备 50 ml 等分试样并快速冷冻。培养基制备前解冻 血球计数器 VWR 15170-208 元 HEPES 系列 西格玛·奥尔德里奇 H3375 在散装储备溶液中制备 40 mM HEPES/8 M 尿素，快速冷冻，在 -20°C 下储存直至使用。每次使用后丢弃（不要反复冻融）。 L-谷氨酰胺 赛默飞世尔科技 25030081 可以分装并冷冻储存。在培养基制备之前解冻。 微量离心机 Eppendorf 埃本多夫 13864457 青霉素 : 链霉素 10k/10k VWR CA12001-692 可以分装并冷冻储存。在培养基制备之前解冻。 磷酸盐缓冲盐水 VWR CA12001-676 不需要购买。也可以制备 PBS，但使用前必须进行无菌过滤。 移液管，一次性血清移液器 （10 mL） Fisher Scientific 公司 13-678-11E 移液管，一次性血清移液器 （25 mL） Basix Fisher Scientific 公司 14955235 胰蛋白酶/Lys-C 蛋白酶混合物，MS 级 刺 编号 A40007 保持在 -20 °C。 尿素 西格玛·奥尔德里奇 U1250-1公斤 在散装储备溶液中制备 40 mM HEPES/8 M 尿素，快速冷冻，在 -20 °C 下储存直至使用。每次使用后丢弃（不要反复冻融）。 酵母提取物蛋白胨葡萄糖汤 BD 迪夫科 BM20 系列

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标签

LDH

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