一种基于渗透膜插入物的感染系统，用于研究细菌毒素的影响

摘要

来源:Flaherty， R. A.， et al.实施基于可渗透膜插入物的感染系统，以研究分泌的细菌毒素对哺乳动物宿主细胞的影响。J. Vis. Exp.（2016 年）。

该视频演示了一种基于渗透性膜插入物的感染系统，用于评估分泌的细菌毒素的影响。通过使用可渗透膜消除细菌病原体和宿主细胞之间的直接接触，该技术允许研究病原菌分泌的毒素对哺乳动物宿主细胞的影响。

方案

1. 细菌培养

1. 生成同基因突变菌株，用于研究特定的目标分泌因子。
   注意:用于这些实验的 GAS（A 组链球菌）M1T1 5448 菌株包括 WT（野生型）GAS'、sagAΔ猫 SLS 缺陷型（sag = 链球菌溶血素 S 相关基因，SLS = 链球菌溶血素 S）突变体（文中缩写为 ΔsagA）和 sagA 互补菌株（文中缩写为 ΔsagA+sagA）。
2. 准备感兴趣的细菌菌株的过夜液体培养物。在感染人类细胞之前，在 37 °C 的 10 ml Todd-Hewitt 肉汤中培养 GAS M1T1 5448 菌株 16-20 小时。
3. 离心过夜细菌培养物（2,400 rcf，10 分钟）并重悬于新鲜细菌培养基中。
   注意:在与过夜培养物生长相同的体积中重悬 （5-10 ml） 通常产生理想的初始光密度。
4. 通过将重悬培养物稀释到额外的细菌培养基中，直到所有待测菌株在 600 nm 处获得相同的光密度 （OD₆₀₀），将细菌培养物标准化至相等的起始浓度（为方便起见，建议使用 OD₆₀₀ 约为 1.0）
   注意:在这些研究中，使用固定相细菌培养物在正常化后立即感染宿主细胞。然而，由于一些细菌菌株不同步地退出固定相，如果发现目标菌株是这种情况，则用对数期培养物开始宿主感染可能更合适。
5. 在进一步分析之前，进行菌落计数测定以确定起始培养物中存在的每毫升菌落形成单位 （CFU），以便确定感染复数 （MOI） 或每个宿主细胞的细菌比率。
   1. 制备 1 ml 细菌培养物的连续稀释液，这些细菌培养物已在磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 或适当的细菌生长培养基（这些研究中使用 Todd-Hewitt 肉汤）中标准化为所需的光密度。制备 ^10-1 到 ^10-6 的稀释液，以产生至少一组具有可计数菌落（30-300 个菌落）的琼脂平板。一式三份进行所有稀释。
   2. 将 100 μl 每个连续稀释液转移到琼脂平板上，该琼脂平板含有适用于所分析细菌种类的培养基><。 注意:这些研究中使用了 Todd-Hewitt 琼脂。
   3. 使用玻璃或塑料细菌涂抹器将 100 μl 等分试样均匀分布在琼脂板的整个表面上，并继续涂抹，直到液体被琼脂吸收。使用无菌技术在火焰下进行。
   4. 将琼脂平板在 37 °C 下孵育过夜或直到出现可计数的菌落。
   5. 计算在每个平板上生长的菌落，并通过以下公式计算原始培养物中的 CFU/ml:菌落数 x 连续稀释/培养体积的倒数（以毫升为单位><）。 例如（200 个菌落 x 1/^10-5 稀释度）/ 0.1 ml 铺板 = 2.0 x 10⁸ CFU/ml。

2. 宿主细胞培养

1. 获得用于所需分析的合适宿主细胞系。
   注意:HaCaT 人上皮角质形成细胞是 V. Nizet 的一份善意礼物，用于这些研究。
   1. 在含有 10% 热灭活胎牛血清 （FBS） 的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM） 中，将 HaCaT 细胞维持在 100 mm 培养皿中。在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育。

3. 使用渗透性膜插入系统感染宿主细胞

1. 将细胞铺板在适当的组织培养皿中，让它们生长直至达到 90% 汇合度。
   注意:这些研究中使用的 HaCaT 细胞通常在铺板后 2-3 天内达到汇合。
   1. 对于裂解物收集（例如信号分析和三磷酸腺苷 （ATP） 测定测定），以大约 3 x 10⁵ 个细胞/孔的接种密度将 HaCaT 细胞接种在 6 孔培养皿中。
   2. 对于免疫荧光成像实验，将细胞接种在 6 孔培养皿内的无菌玻璃盖玻片上，接种密度约为 3 x 10⁵ 个细胞/孔。
   3. 对于乙锭同型二聚体膜透化和乳酸脱氢酶 （LDH） 释放测定，以大约 5 x 10⁴ 个细胞/孔的接种密度在 24 孔培养皿中接种 HaCaT 细胞。
2. 在处理之前，用 1x 无菌 PBS 洗涤细胞。
3. 将新鲜生长培养基涂覆到细胞中。对于此处描述的条件，对于 6 孔板，每孔添加 2 ml 培养基，对于 24 孔板，每孔添加 0.5 ml 培养基。如果正在测试药物治疗，请与新鲜培养基混合，并在此步骤中施用><。 注意:某些检测可能需要替代培养基。例如，由于酚红和高血清浓度会干扰 LDH 释放测定，因此使用不含酚红的 Dulbecco 改良鹰培养基 （DMEM），补充有 1% 牛血清白蛋白 （BSA） （w/v）、2 mM L-谷氨酰胺和 1 mM 丙酮酸钠用于这些实验。
4. 加入新鲜培养基后，小心地将无菌的 0.4 μm 可渗透膜插入物放入每个孔中。在层流罩中执行此步骤，并使用无菌镊子将可渗透膜插入物转移到每个孔中。
5. 根据制造商的说明，将新鲜的细胞培养基添加到每个孔的上腔室中。对于此处描述的条件，对于 6 孔板，每孔涂抹 1 ml 培养基，对于 24 孔板，每孔涂抹 0.1 ml 培养基。
6. 将适当体积的标准化细菌培养物（参见第 1 节）应用于可渗透膜插入系统的上腔室。使用细菌培养基进行未感染的对照治疗。对于此处描述的结果，对于 24 孔板，每个腔室添加 25 μl 标准化培养物，对于 6 孔板，每个腔室添加 100 μl 培养物><。 注意:在这些研究中，将野生型或突变型 GAS 应用于 MOI 为 10 的宿主细胞。MOI 是根据最终的真核细胞数量（例如 2 x 10⁶ 个细胞/孔）计算的，因此在感染期开始时，每个宿主细胞添加的细菌数量是 10 倍（例如，每孔 2 x 10⁷ CFU）。适当的 MOI 会因不同的细菌种类和所需的后续分析而异。
   注意:除了将细菌培养基用于未感染的对照外，对于该技术的某些应用，其他有用的对照可能包括热灭活细菌或用过的细菌培养基进行比较。
7. 将感染的细胞在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育。

4. 样本集合

1. 要收集细胞培养基、宿主细胞裂解物或带有完整细胞的玻璃盖玻片以进行后续分析，首先用无菌镊子小心地去除可渗透的膜插入物。
2. 用于评估分泌的宿主蛋白:
   将
   1. 培养基从下腔收集到 1.5 ml 试管中。避免在收集过程中干扰单层。
   2. 将样品在 4 °C 下以 14,000 rcf 离心 10 分钟以去除细胞碎片。
   3. 将除 50 μl 上清液外的所有上清液除入新的 1.5 ml 管中，并储存在 -20 °C 或立即使用。

材料