一种基于可渗透膜插入装置的感染系统用于研究细菌毒素的影响

摘要

来源：Flaherty, R. A.，等。利用可渗透膜插件感染系统研究分泌型细菌毒素对哺乳动物宿主细胞的影响。J. Vis. Exp. (2016)。

本视频展示了一种基于可渗透膜插入物的感染系统，用于评估分泌型细菌毒素的影响。该技术利用可渗透膜阻断细菌病原体与宿主细胞之间的直接接触，从而能够研究致病菌分泌的毒素对哺乳动物宿主细胞的作用。

方案

1. 细菌培养

1. 构建同基因型突变菌株，用于研究特定分泌因子的功能。
   注意：本实验所用的A族链球菌（GAS, Group A Streptococcus）M1T1 5448菌株包括野生型（WT, Wild type）GAS、sagAΔcat SLS缺陷型突变株（sag = 链球菌溶血素S相关基因，SLS = 链球菌溶血素S）（文中简称为 ΔsagA），以及sagA基因回补菌株（文中简称为 ΔsagA+sagA）。
2. 准备目标细菌菌株的过夜液体培养物。  在感染人源细胞前，将GAS M1T1 5448菌株于10 ml Todd-Hewitt液体培养基中，37 °C条件下培养16–20小时。
3. 将过夜培养的细菌培养物离心（2,400 rcf，10分钟），并重悬于新鲜的细菌培养基中。
   注意： 通常使用与过夜培养相同体积的培养基进行重悬（5–10 ml），可获得理想的初始光密度。
4. 通过向重悬的菌液中加入额外的细菌培养基进行稀释，使各待测菌株的起始浓度一致，即在600 nm波长下达到相同的光密度（OD₆₀₀）（为方便起见，建议调整至OD₆₀₀约为1.0）。
   注意： 本研究中，使用处于稳定期的细菌培养物在标准化后立即用于感染宿主细胞。然而，由于某些细菌菌株退出稳定期的时间不同步，在此类情况下，使用对数生长期的培养物开始宿主感染可能更为合适。
5. 在进一步分析之前，进行菌落计数实验，以确定起始培养物中每毫升的菌落形成单位（CFU），从而计算感染复数（MOI），即每个宿主细胞对应的细菌数量。
   1. 将已调整至目标光密度的细菌培养物用磷酸盐缓冲液（PBS）或适当的细菌生长培养基（本研究中使用Todd-Hewitt broth）进行1 ml系列稀释。制备从10^-1到10^-6的稀释梯度，以确保至少有一组琼脂平板上的菌落数量可计（30–300个菌落）。所有稀释步骤均需设三个重复。
   2. 取每个系列稀释液100 µl，接种至含有适合待分析菌种生长的培养基的琼脂平板上。
      注意： 本研究中使用Todd-Hewitt琼脂平板。
   3. 使用玻璃或塑料涂布棒将100 µl样品均匀涂布于琼脂平板表面，持续涂布直至液体完全被琼脂吸收。操作过程应在火焰旁无菌条件下进行。
   4. 将琼脂平板置于37 °C培养过夜，或直至出现可计数的菌落。
   5. 计数每个平板上生长的菌落数，并根据以下公式计算原始培养物中的CFU/ml：菌落数 × 稀释倍数的倒数 / 接种体积（单位为毫升）。
      例如：（200个菌落 × 1/10^-5稀释倍数）/ 0.1 ml 接种量 = 2.0 × 10⁸ CFU/ml。

2. 宿主细胞培养

1. 为所需的分析选择合适的宿主细胞系。
   注意：本研究使用了由 V. Nizet 惠赠的 HaCaT 人表皮角质形成细胞。
   1. 将 HaCaT 细胞培养于含 10% 热灭活胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中，置于 100 mm 培养皿内。在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育。

3. 利用可渗透膜插入系统感染宿主细胞

1. 将细胞接种于合适的组织培养皿中，培养至细胞融合度达到90%。
   注意： 这些研究中使用的 HaCaT 细胞通常在接种后 2 至 3 天内达到汇合状态。
   1. 用于裂解液收集（例如 信号分析和三磷酸腺苷（ATP）测定实验），将HaCaT细胞以约3 x 10⁵的接种密度接种于6孔板中⁵ 细胞/孔
   2. 用于免疫荧光成像实验时，将细胞以约 3 x 10⁵ 个/孔的接种密度接种于 6 孔板中的无菌玻璃盖玻片上⁵ 细胞/孔
   3. 对于溴化乙锭同型二聚体膜通透性和乳酸脱氢酶（LDH）释放检测，将HaCaT细胞以约5 x 10⁵的接种密度接种于24孔板中⁴ 细胞/孔
2. 处理前立即用1×无菌PBS洗涤细胞。
3. 向细胞中加入新鲜培养基。针对此处描述的实验条件，6孔板每孔加入2 ml培养基，24孔板每孔加入0.5 ml培养基。若需进行药物处理，应将药物与新鲜培养基混合后，在此步骤中加入。
   注意：某些检测可能需要使用替代培养基。例如，由于酚红和高浓度血清会干扰乳酸脱氢酶（LDH）释放检测，因此本实验采用不含酚红的杜氏改良伊格尔培养基（Dulbecco's modified eagle's medium, DMEM），并添加1%牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）（w/v）、2 mM L-谷氨酰胺和1 mM丙酮酸钠。
4. 新鲜培养基添加后，将无菌的0.4 µm通透性膜插入物小心地放入每个孔中。此操作应在层流罩内进行，并使用无菌镊子将通透性膜插入物转移至各孔中。
5. 根据制造商说明书，向每个孔的上室加入新鲜细胞培养基。对于本实验所述条件，6孔板每孔加入1 ml培养基，24孔板每孔加入0.1 ml培养基。
6. 将适量的标准化细菌培养物（见第1部分）加入可渗透膜插件系统的上室中。未感染的对照组使用细菌培养基。本实验结果中，每孔加入25 µl标准化培养物用于24孔板，每孔加入100 µl用于6孔板。
   注意：在这些研究中，将野生型或突变型GAS以感染复数（MOI）为10的剂量施加于宿主细胞。MOI根据最终的真核细胞数量计算得出。例如 2 x 10⁶ 细胞/孔），使得感染初期每宿主细胞所添加的细菌数量为原来的10倍（例如 2 x 10⁷ 每孔菌落形成单位（CFU）。合适的感染复数（MOI）将因不同细菌种类及预期的后续分析而异。
   注意： 除了使用细菌培养基作为未感染对照外，该技术在某些应用中还可采用热灭活细菌或细菌耗尽培养基作为其他有用的对照进行比较。
7. 将感染的细胞在37 °C、5% CO₂条件下孵育₂.

4. 样本采集

1. 为收集细胞培养基、宿主细胞裂解物或带有完整细胞的玻璃盖玻片以用于后续分析，需使用无菌镊子小心取出可渗透膜插件。
2. 分泌型宿主蛋白的检测：
   1. 将下室中的培养基收集至1.5 ml离心管中。收集过程中避免扰动单层细胞。
   2. 在4 °C条件下，以14,000 rcf离心10分钟，以去除细胞碎片。
   3. 将上清液转移至新的1.5 ml离心管中，仅留50 µl，其余弃去；样品可于-20 °C保存或立即使用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Todd-Hewitt 肉汤	Acumedia	7161A	使用适合目标细菌种类的肉汤。
BioSpectrometer	Eppendorf	basic model	任何紫外-可见分光光度计均可使用。
培养皿	Fisher Scientific	FB0875713	其他品牌亦适用。
琼脂	Sigma	A1296-1kg	其他品牌亦适用。
HaCaT 人表皮角质形成细胞			由 Victor Nizet 实验室惠赠。
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Life Technologies	11995-073	使用适合目标细胞系的培养基。
胎牛血清（FBS）	Biowest	S162H	使用适合目标细胞系的培养基添加剂。
10 cm 组织培养皿	Nunc	150350	其他品牌亦适用。
6 孔组织培养皿	CytoOne	cc7682-7506	其他品牌亦适用，但需与 Corning 插件兼容。
24 孔组织培养皿	CytoOne	cc7682-7524	其他品牌亦适用，但需与 Corning 插件兼容。
玻璃盖玻片	Fisherbrand	12-541-B	用于细胞接种前必须进行高压灭菌。
磷酸盐缓冲液（PBS）	Gibco	10010-023
无酚红 DMEM	Life Technologies	31053028	仅乳酸脱氢酶（LDH）释放实验需要无酚红培养基。
牛血清白蛋白（BSA）	Fisher Scientific	BP1600-100
L-谷氨酰胺	Gibco	25030149	仅用于补充 LDH 释放实验的细胞培养基。
丙酮酸钠	Gibco	BP356100	仅用于补充 LDH 释放实验的细胞培养基。
胶原包被 0.4 μm Transwell 插件（6 孔）	Corning	3540
胶原包被 0.4 μm Transwell 插件（24 孔）	Corning	3595
镊子	Fisher	3120018	操作 Transwell 插件前必须用乙醇灭菌。
细胞刮刀	Fisherbrand	08-100-241	仅用于收集细胞裂解物。