从感染宿主细胞中提取细胞裂解液（宿主细胞培养于可渗透膜系统中）

摘要

来源：Flaherty, R. A.，等。利用可渗透膜插件感染系统研究分泌型细菌毒素对哺乳动物宿主细胞的影响。J. Vis. Exp. (2016)。

本视频展示了一种可渗透膜插入系统，用于以受控且隔离的方式研究细菌毒素对宿主细胞的影响。该方法可选择性地使细胞暴露于毒素，同时保持物理分隔，模拟天然的宿主-病原体相互作用。

方案

1. 细菌培养

1. 生成用于研究特定分泌因子的同基因型突变菌株。
   注意： 用于本实验的 GASM1T1 5448 毒株包括野生型（WT）链球菌菌株 GAS' a sagAΔ猫 SLS缺陷型突变体（文中简称为Δ）sagA）和一个 sagA 互补菌株（文中简写为 Δ）sagA+sagA).
2. 制备目标菌株的过夜液体培养物。  在含有 GAS M1T1 5448 菌株的培养基中培养  - 感染人细胞前，在37°C下用10 ml Todd-Hewitt肉汤培养16–20小时。
3. 离心过夜培养的细菌（2,400 rcf，10 分钟），并重悬于新鲜细菌培养基中。
   注意： 在与过夜培养相同体积（5-10 ml）的溶液中重悬，通常可获得理想的初始光密度。
4. 通过在额外的细菌培养基中稀释重悬的菌液，将各细菌培养物调整至相同的起始浓度，使所有待测菌株在600 nm处的光密度（OD600）一致（为便于操作，建议调整至OD600约为1.0）。
   注意： 在这些研究中，使用经过标准化处理后的静止期细菌培养物立即感染宿主细胞。然而，由于某些细菌菌株退出静止期并不同步，若目标菌株存在此类情....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
HaCaT 人源表皮角质形成细胞			由 Victor Nizet 实验室惠赠。
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Life Technologies	11995-073	请使用适用于目标细胞系的适当培养基。
胎牛血清（FBS）	Biowest	S162H	请使用适用于目标细胞系的适当培养基添加剂。
10 cm 组织培养皿	Nunc	150350	其他品牌亦适用。
6 孔组织培养皿	CytoOne	cc7682-7506	其他品牌亦适用，但需与 Corning 插件兼容。
胶原包被 0.4 μm Transwell 插件（6 孔）	Corning	3540
胶原包被 0.4 μm Transwell 插件（24 孔）	Corning	3595
细胞刮刀	Fisherbrand	08-100-241	仅用于收集细胞裂解液时需要。
Nonidet P40 替代品	Sigma	74385-1L	其他供应商的产品亦适用。