从感染宿主细胞中提取细胞裂解液（宿主细胞培养于可渗透膜系统中）

摘要

来源：Flaherty, R. A.，等。利用可渗透膜插件感染系统研究分泌型细菌毒素对哺乳动物宿主细胞的影响。J. Vis. Exp. (2016)。

本视频展示了一种可渗透膜插入系统，用于以受控且隔离的方式研究细菌毒素对宿主细胞的影响。该方法可选择性地使细胞暴露于毒素，同时保持物理分隔，模拟天然的宿主-病原体相互作用。

方案

1. 细菌培养

1. 生成用于研究特定分泌因子的同基因型突变菌株。
   注意： 用于本实验的 GASM1T1 5448 毒株包括野生型（WT）链球菌菌株 GAS' a sagAΔ猫 SLS缺陷型突变体（文中简称为Δ）sagA）和一个 sagA 互补菌株（文中简写为 Δ）sagA+sagA).
2. 制备目标菌株的过夜液体培养物。  在含有 GAS M1T1 5448 菌株的培养基中培养  - 感染人细胞前，在37°C下用10 ml Todd-Hewitt肉汤培养16–20小时。
3. 离心过夜培养的细菌（2,400 rcf，10 分钟），并重悬于新鲜细菌培养基中。
   注意： 在与过夜培养相同体积（5-10 ml）的溶液中重悬，通常可获得理想的初始光密度。
4. 通过在额外的细菌培养基中稀释重悬的菌液，将各细菌培养物调整至相同的起始浓度，使所有待测菌株在600 nm处的光密度（OD600）一致（为便于操作，建议调整至OD600约为1.0）。
   注意： 在这些研究中，使用经过标准化处理后的静止期细菌培养物立即感染宿主细胞。然而，由于某些细菌菌株退出静止期并不同步，若目标菌株存在此类情况，则采用对数生长期的培养物起始宿主感染可能更为合适。
5. 在进行进一步分析之前，需进行菌落计数实验，以测定起始培养物中每毫升所含的菌落形成单位（CFU），从而确定感染复数（MOI），即每个宿主细胞所对应的细菌数量比例。
   1. 将细菌培养物用磷酸盐缓冲液（PBS）或适当的细菌培养基（本研究中使用Todd-Hewitt肉汤）调整至目标光密度后，制备1 ml系列稀释液。稀释梯度范围从10⁻¹开始^-1 稀释至10-6，以获得至少一组菌落数可计数（30-300个菌落）的琼脂平板。所有稀释步骤均需设三个重复。
   2. 将每种连续稀释液各100 µl转移至含有适合待分析细菌物种培养基的琼脂平板上。
      注意： 这些研究中使用了Todd-Hewitt琼脂。
   3. 使用玻璃或塑料涂布棒将100 µl样品均匀涂布于琼脂平板表面，继续涂布直至液体完全被琼脂吸收。操作过程应在火焰旁无菌条件下进行。
   4. 将琼脂平板在37°C下孵育过夜，或孵育至出现可计数的菌落。
   5. 计数每个平板上生长的菌落数，并按以下公式计算原始培养物中的CFU/ml：菌落数 × 系列稀释倍数的倒数 / 接种培养物的体积（毫升）。
      例如 （200 个菌落 × 1/10）^-5 稀释倍数) / 0.1 ml 涂布 = 2.0 × 10⁸ CFU/ml

2. 宿主细胞培养

1. 获取适用于所需分析的适当宿主细胞系。
   注意： HaCaT 人表皮角质形成细胞（由 V. Nizet 惠赠）被用于本研究。
   1. 在含有10%热灭活胎牛血清（FBS）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中，将HaCaT细胞培养于100 mm培养皿中。于37°C、5% CO₂条件下孵育₂.

3. 利用可渗透膜插入系统感染宿主细胞

1. 将细胞接种于合适的组织培养皿中，并培养至细胞融合度达到90%。
   注意这些研究中使用的 HaCaT 细胞通常在接种后 2–3 天内达到汇合。
   1. 用于裂解液收集（例如 信号分析和三磷酸腺苷（ATP）测定实验），以约 3 x 10⁵ 个细胞/孔的接种密度将 HaCaT 细胞接种于 6 孔板中⁵ 细胞/孔
   2. 进行免疫荧光成像实验时，将细胞以约 3 x 10⁵ 个/孔的接种密度接种于 6 孔板中的无菌玻璃盖玻片上⁵ 细胞/孔
   3. 对于溴化乙锭同型二聚体膜通透性和乳酸脱氢酶（LDH）释放检测，将HaCaT细胞以约5 x 10⁵的接种密度接种于24孔板中⁴ 细胞/孔
2. 处理前立即用1×无菌PBS洗涤细胞。
3. 向细胞中加入新鲜培养基。针对此处描述的实验条件，6孔板每孔加入2 ml培养基，24孔板每孔加入0.5 ml培养基。若需进行药理学处理，应将药物与新鲜培养基混合后在此步骤中加入。
   注意： 某些检测可能需要使用替代培养基。例如，由于酚红和高浓度血清会干扰乳酸脱氢酶（LDH）释放检测，因此本实验采用不含酚红的DMEM培养基，并添加1%牛血清白蛋白（BSA，w/v）、2 mM L-谷氨酰胺和1 mM丙酮酸钠。
4. 新鲜培养基加入后，将无菌的0.4 µm通透性膜插件小心放入每个孔中。此操作应在层流罩内进行，并使用无菌镊子将通透性膜插件转移至各孔。
5. 根据制造商说明书，向每个孔的上室加入新鲜细胞培养基。对于本实验所述条件，6孔板每孔加入1 ml培养基，24孔板每孔加入0.1 ml培养基。
6. 将适量的标准化细菌培养物（见第1部分）加入可渗透膜插件系统的上室中。未感染的对照组使用细菌培养基。本实验结果中，24孔板每孔加入25 µl标准化培养物，6孔板每孔加入100 µl标准化培养物。
   注意：在这些研究中，将野生型或突变型GAS以感染复数（MOI）为10的剂量施加于宿主细胞。MOI根据最终的真核细胞数量计算得出。例如 2 x 10⁶ 细胞/孔），使得感染初期每宿主细胞所添加的细菌数量为原来的10倍（例如 2 × 10⁷ 每孔菌落形成单位（CFU）。合适的感染复数（MOI）将因不同细菌种类及所需的后续分析而异。
   注意除了使用细菌培养基作为未感染对照外，该技术在某些应用中还可采用热灭活细菌或细菌耗尽培养基作为其他有用的对照进行比较。
7. 将感染的细胞在37 °C、5% CO₂条件下孵育₂.

4. 样本采集

1. 为收集细胞培养基、宿主细胞裂解物或带有完整细胞的玻璃盖玻片以进行后续分析，首先使用无菌镊子小心取出可渗透膜插入物。
2. 宿主细胞裂解物的检测：
   1. 轻轻吸除宿主细胞单层上方的培养基。避免扰动单层细胞，以免造成样品损失。
   2. 用1× PBS冲洗细胞一次。
   3. 轻轻吸除PBS。立即加入适量预冷的裂解缓冲液，以达到所需的蛋白浓度，并将样品置于冰上孵育15分钟。每6孔板的每个孔加入200 µl至350 µl裂解缓冲液，使蛋白浓度达到0.5至1.5 mg/ml。
      注意：本研究中使用的裂解缓冲液由去离子水、1%（v/v）Nonidet P40替代物、磷酸酶抑制剂混合物和蛋白酶抑制剂混合物组成。具体试剂见材料与设备部分。
   4. 使用细胞刮刀将细胞从每个孔的培养板表面刮下，并将每个孔的全部内容物转移至1.5 ml离心管中。
   5. 在4°C下以14,000 rcf离心20分钟。
   6. 如需检测可溶性裂解成分，将上清液转移至新管中，于-20°C保存或立即使用。
   7. 如需检测核成分或其他不溶性裂解成分，保留沉淀物，于-20°C保存或立即使用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
HaCaT 人源表皮角质形成细胞			由 Victor Nizet 实验室惠赠。
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Life Technologies	11995-073	请使用适用于目标细胞系的适当培养基。
胎牛血清（FBS）	Biowest	S162H	请使用适用于目标细胞系的适当培养基添加剂。
10 cm 组织培养皿	Nunc	150350	其他品牌亦适用。
6 孔组织培养皿	CytoOne	cc7682-7506	其他品牌亦适用，但需与 Corning 插件兼容。
胶原包被 0.4 μm Transwell 插件（6 孔）	Corning	3540
胶原包被 0.4 μm Transwell 插件（24 孔）	Corning	3595
细胞刮刀	Fisherbrand	08-100-241	仅用于收集细胞裂解液时需要。
Nonidet P40 替代品	Sigma	74385-1L	其他供应商的产品亦适用。