利用荧光成像检测细菌对宿主细胞的黏附

摘要

来源：Yang, J., 等. 细菌黏附宿主细胞的自动化高通量检测。J. Vis. Exp. (2021)

本视频展示了细菌黏附实验，用于评估GFP标记的细菌对上皮细胞培养物的黏附能力，从而利用基于荧光显微镜的成像技术研究宿主-病原体相互作用的动力学。

方案

1. 细菌黏附与宿主细胞染色

1. 首先，用预热的1×PBS将接种了A549细胞的单层细胞洗涤三次。每次洗涤时，向每个孔中加入100 μL 1×PBS，轻轻吹打3次，弃去1×PBS，或在加入后等待10秒，然后用真空泵吸除1×PBS。为测定细菌结合动力学，向细胞中加入100 µL含不同感染复数（MOI）（0、1、10和100）的所需浓度细菌悬液。在200 × g 条件下离心10分钟，然后将感染的A549细胞在37 °C、5% CO₂ 条件下继续孵育1小时。
   注意：本实验中，每种条件均设置技术重复三孔。
2. 按照上述方法，用预热的1×PBS将单层细胞洗涤五次，以去除未结合的细菌。向96孔板的每个孔中加入100 µL 4%多聚甲醛（溶于1×PBS中）以固定细胞。将板置于冰上静置15分钟，然后用1×PBS洗涤三次，去除固定液。
3. 为染色细胞核，加入50 ng/mL的4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI），室温孵育10分钟。孵育结束后，用1×PBS洗涤三次。向感染的A549细胞中加入100 µL 1×PBS，防止干燥。立即进行下一步操作，或在避光条件下于4 °C保存最多2天。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10x PBS	VWR	45001-130
4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）	赛默飞世尔科技	62248	宿主细胞染色染料
96孔板	康宁	3882	半区孔板，平底透明
A549 细胞	ATCC	CCL 185	哺乳动物细胞系
离心	Eppendorf	5810R
OD600 稀释光度计	IMPLEN
典型的豆汤培养基	培养细胞	MBPE-4040
F-12k 培养基	ATCC	302004	A549细胞培养基
胎牛血清	康宁	35-016-CV