一种用于研究细菌感染细胞中钙反应的成像技术

摘要

来源：Smail, Y., 等 成像 Ca²⁺ 反应期间 志贺氏菌 上皮细胞感染 视频实验杂志 (2018).

本视频演示了一种检测局部和全局钙离子反应的方法 志贺氏菌 人上皮细胞感染。 志贺氏菌 侵入宿主细胞并释放入侵效应分子，影响细胞内钙离子水平。通过荧光指示剂研究局部和全局胞质钙离子的振幅与频率。

方案

1. 准备工作

1. 细菌准备
   1. 将表达AfaE黏附素的Shigella野生型菌株（M90T-AfaE）接种于含0.01%刚果红（CR）的胰蛋白胨大豆（TCS）琼脂平板上，37 °C培养18小时。
      注意：为提高可重复性，步骤1.1.1获得的Shigella平板应保存于4 °C，且应在一周内使用，因为所有在CR培养基上的菌落在随时间推移后最终会变为红色。
   2. 从划线平板上挑取3个红色菌落，接种至TCS液体培养基中进行预培养。
      注意：接种3个菌落是为了降低挑取到单个克隆（其毒力质粒可能发生遗传重组）的概率。
   3. 将细菌液体培养物置于摇床培养箱中，37 °C、200 rpm振荡培养16小时。加入氨苄青霉素至终浓度为75 mg/mL。抗生素浓度不应超过最低抑菌浓度的3倍，因为过量抗生素可能导致大型毒力质粒丢失。
      注意：应通过将细菌培养物接种至含适当抗生素浓度的CR平板上来验证Shigella毒力质粒的维持情况。出现白色菌落表明质粒丢失。
   4. 以1:100的比例将预培养菌液接种至TCS培养基中，在37 °C、200 rpm摇床培养箱中孵育2小时。确保600 nm处的光密度（OD_600nm）为0.2–0.4。
   5. 在21 °C下以13,000 × g离心细菌培养物2分钟，并将沉淀重悬于等体积的EM培养基（120 mM NaCl、7 mM KCl、1.8 mM CaCl₂、0.8 mM MgCl₂、5 mM葡萄糖和25 mM HEPES，pH = 7.3）中。
   6. 将细菌悬液用EM缓冲液稀释至终OD_600nm为0.1，立即使用或在21 °C保存并在接下来的60分钟内使用。
2. 细胞准备
   1. 在含1 g/L葡萄糖并补充10%胎牛血清（FCS）的DMEM培养基中培养HeLa细胞，于37 °C、10% CO₂条件下生长。TC-7细胞则在含4.5 g/L葡萄糖、10% FCS及非必需氨基酸的DMEM培养基中，于37 °C、10% CO₂培养箱中培养。
   2. 为维持细胞状态，需定期传代以避免因汇合状态引起的生长接触抑制；这对实现高Ca²⁺探针负载/转染效率至关重要。
   3. 实验前一天，将HeLa细胞以每孔3 × 10⁵个细胞的密度接种于6孔板中的无菌25 mm直径圆形盖玻片上。
   4. 对于TC-7细胞，进行胰酶消化并计数后，以每孔4 × 10⁵个细胞的密度接种，并在10% CO₂培养箱中37 °C孵育5–7天，以使其充分极化。
      1. 每天更换细胞培养基直至实验当天。
         注意：也可使用35 mm直径的玻璃底一次性培养皿替代含盖玻片的孔板。若使用后者，则仅通过加热载物台或物镜进行温度控制是不够的，还需在显微镜载物台上安装恒温培养舱。
3. 实验当天，移除培养基，并用1 mL EM培养基于21 °C洗涤细胞3次。
4. 在EM缓冲液中加入3 mM Fluo-4/乙酰甲酯（Fluo-4-AM），于21 °C孵育30分钟以负载细胞。
   注意：虽然亚汇合状态的HeLa细胞负载过程通常无显著问题，但极化后的TC-7细胞负载常呈现异质性且效率较低。我们发现，在含Fluo-4-AM的EM缓冲液中添加终浓度为0.1%的分散剂——普流尼克酸（pluronic acid）以及终浓度为20 µM的阴离子转运抑制剂溴磺酞（bromosulfophtalein），可提高此类细胞的负载效率。由于局部Ca²⁺响应成像所需的采集速度较快，因此不适合使用需双波长采集的比例型化学探针或基因编码的FRET探针。
5. 用EM缓冲液洗涤样品3次，再加入1 mL EM缓冲液于21 °C继续孵育，以促进AM基团的水解。Fluo-4负载后的细胞应立即使用或在接下来的90分钟内使用（保持在21 °C）。

2. 局部Ca²⁺反应的感染与图像采集

1. 将载有Fluo-4染色细胞的盖玻片置于成像室或玻璃底培养皿中。在成像室或一次性玻璃底培养皿中用EM缓冲液洗涤样品3次，以去除可能由细胞裂解释放的成分。加入1 mL EM缓冲液。
2. 将培养室置于倒置荧光显微镜载物台上，温度维持在 33 °C。
   注意： 该温度的选择是在与反应相容的最佳温度之间进行权衡的结果 志贺氏菌 侵袭过程及钙信号的减缓²⁺ 通过63倍油镜（数值孔径NA = 1.25）观察局部反应，该物镜配备相差环。
3. 选择显微观察视野，并根据需要设置采集参数，包括曝光时间和像素合并，以优化 Fluo-4 荧光信号。
   注意： 局部Ca²⁺信号的主要挑战²⁺ 成像面临的主要挑战是响应信号的幅度较低且持续时间较短，因此要求至少每30毫秒采集一次数据。目前市面上多种背照式电子倍增电荷耦合器件（EM-CCD）或互补金属氧化物半导体（C-MOS）相机具备足够的灵敏度，可用于检测局部Ca²⁺ 使用Fluo-4检测反应。检测灵敏度也是限制光损伤或由Fluo-4在高频率荧光激发下引发的自发反应等伪影的重要因素。本实验采用基于LED的470 nm照明，配备480 ± 40 nm带通激发滤光片、505 nm二向色镜和527 ± 30 nm带通发射滤光片，光照强度设置为最大强度的5%，并结合1.0中性密度滤光片，以在有限时长的连续采集过程中最大限度地减少上述问题。对局部Ca²+ 以每批120秒的连续成像进行信号采集是常规操作。在这些低光照条件下，2分钟的成像过程中未观察到荧光染料的光漂白现象。只要使用不同的视野，即可对同一样本进行连续多次采集。通常情况下，首先在无细菌刺激的情况下对对照视野进行第一次成像采集，以确认不存在自发性反应。若观察到自发性反应，则用EM缓冲液冲洗样本，直至不再出现反应为止。
4. 向样品中添加细菌时，从腔室中移除 500 µL EM 缓冲液，并加入在步骤 1.1.6 中制备的 500 µL 细菌悬液，以获得最终 OD_{600 nm} 0.05，同时需注意避免移动选定的显微镜视野；该体积可确保细菌充分混合，并在细胞样本上均匀分布。
5. 在加入细菌后立即进行图像采集。或者，在加入细菌后10分钟进行图像采集，该时间对应于在所用条件下细菌沉降到细胞表面所需的时间。在采集结束时，对选定视野获取相差图像，以观察与细胞接触的细菌以及与细菌侵入位点相关的细胞膜皱褶。
6. 重复步骤2.5中的采集程序，间隔时间应适应图像采集、文件保存以及选择新视野所需的时间，以覆盖整个过程。
   注意：对于 志贺氏菌我们发现，在细菌沉降10分钟后，每隔5分钟采集一次、持续20分钟的采集流，能够覆盖大多数侵袭事件。
7. 在采集程序结束时，加入终浓度为 2 µM 的 Ca²⁺ 离子载体离子霉素样品以确定Ca²⁺反应的最大振幅²⁺ 信号。每3-5秒采集一次图像，直至信号稳定，通常不超过10分钟。
8. 随后加入 Ca²⁺ 螯合剂乙二醇双(β-氨基乙基醚)-N,N,N′,N′-四乙酸（EGTA）以终浓度10 mM处理，用于测定无Ca²⁺条件下的荧光信号²⁺每3至5秒采集一次图像，直至信号稳定，通常持续时间少于10分钟。
   注意： 由于全局Ca信号的动力学过程相对较慢²⁺ 变化，每隔 3 - 5 秒进行一次采集（非流式模式），以允许 Ca²⁺ 在连续处理过程中对同一显微视野进行成像。

3. 分析

1. 表达细胞质 Ca²⁺ 随时间变化的 ΔF/F0 百分比，其中 ΔF 代表感兴趣区域（ROI）平均荧光强度的变化，F0 代表同一 ROI 的基线荧光强度，二者均减去视野中无细胞区域的非相关信号。
   1. 去除不同视野中每个细胞的基底荧光水平，即对应于基线水平的信号；由于局部Ca²⁺事件频率较低且持续时间相对较短，这些基底水平可被明确确定。²⁺ 在特定流式采集中的响应
      ​注意：应量化与所提问题及所研究的致病模型相关的反应特征。传统上，分析Ca²⁺ 信号，包括显示局部或全局 Ca 的细胞频率²⁺ 反应，以及这些反应的持续时间、幅度和频率。在……的情况下 志贺氏菌 以及局部反应，分析的另一个重要方面是反应与细菌侵入位点之间的空间关联性。
2. 为量化显示全局或局部反应的响应细胞百分比，在 Fluo-4 荧光强度变化对应的时间序列中，于细胞内绘制感兴趣区域（ROIs）。
   1. 设定严格参数以识别局部 Ca²⁺ 反应需满足特定标准，例如荧光强度平均细胞基线背景波动幅度的三倍以上，或持续时间至少200毫秒，以避免误判为假阳性。
      注意： 一般而言，即使微小的局部Ca²⁺ 通过其特征曲线可以将信号响应与背景噪声区分开来。感兴趣区域（ROIs）应足够大，以整合足够的荧光信号，从而能够检测局部变化。根据Fluo-4检测信号的强度，这些感兴趣区域可能对应直径为2 - 5 mM的圆形区域。
   2. 在同一个细胞的不同区域测量两处平均 Fluo-4 荧光强度的变化，以确定反应是局部的还是全局的。
      注意： 通过使用成像软件，可在线显示所选区域平均荧光强度随时间变化的曲线，从而便于对大量细胞进行分析。市面上的成像软件通常具备此类功能，但也可通过以下方法实现 冰冷 免费软件，使用 ROI 强度变化 插件
   3. 确定表现出局部反应的细胞百分比。
      注意： 该百分比根据显微镜视野中分析的细胞总数计算得出，细胞数量应足够以支持采用非参数检验进行统计学显著性分析。
   4. 确定局部反应的持续时间。
      注意： 局部Ca²⁺ 可根据其持续时间范围进一步区分反应即， 小于500毫秒、5到10秒之间，或超过10秒）及其与 志贺氏菌 侵袭位点
3. 量化反应的幅度。首先，校准最大Ca²⁺ 并根据步骤2.1.7确定细胞背景水平。由于每个细胞的Fluo-4负载量可能不同，需对视野中的单个细胞分别进行上述测定。
   1. 将反应幅度表示为最大反应的相对百分比。
   2. 使用正态性检验进行统计学检验，随后采用参数检验分析样本间反应幅度的潜在差异。
   3. 通过将这些反应与相应相差图像中观察到的细菌诱导的膜皱褶的定位进行对应，确定其与细菌侵袭位点的关联性。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Fluo-4 AM	Invitrogen	F14201
Metamorph 版本 7.7	Universal Imaging
CoolLED 照明系统 pE-2	Roper Scientific
35 mm 高底培养皿	IBIDI	81156
胰蛋白胨大豆（TCS）肉汤	Thermofisher	B11768
TCS 琼脂	Thermofisher	B11043
刚果红	Sigma-Aldrich	75768
M90T-AfaE	Sun et al. 2017		志贺氏菌 flexneri 血清型 V，表达 AfaE 黏附素
ipgD-AfaE	Sun et al. 2017		表达 AfaE 黏附素的同基因 ipgD 突变株