利用成像流式细胞术分析人T细胞与SEB负载的Raji细胞之间的免疫突触

摘要

来源：  Wabnitz, G. 等，利用成像流式细胞术对人类系统中免疫突触进行定性和定量分析。J. Vis. Exp. (2019)

该视频分析了未纯化的全白细胞制剂中T细胞之间免疫突触的形成 金黄色葡萄球菌 肠毒素B，SEB负载的Raji细胞。通过成像流式细胞术观察到免疫突触中CD3和F-肌动蛋白的富集。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 全白细胞的制备

1. 使用肝素化注射器从健康供体（或患者）抽取1 mL外周血。确保已获得相关伦理委员会对献血的批准。
2. 在50 mL离心管中，将1 mL人外周血与30 mL ACK裂解缓冲液（150 mM NH₄Cl、1 mM KHCO₃ 和 0.1 mM EDTA，pH 7.0）混合，并在室温下孵育8分钟。
3. 用PBS补满离心管，以300 x g 离心6分钟。吸除上清液，并将沉淀重悬于30 mL ACK裂解缓冲液中。
4. 重复步骤1.2和1.3，直至上清液澄清。最后用PBS洗涤细胞，于室温下以300 x g 离心6分钟，将细胞沉淀重悬于2 mL培养基（RPMI1640 + 10% FCS）中。将细胞在37 °C孵育60分钟。

2. 使用 SEB 负载 Raji 细胞

1. 准备两个15 mL Falcon离心管，每管中加入1.5 × 10⁶个Raji细胞。离心（300 × g，室温，6分钟），弃去上清液。
2. 将细胞重悬于残留....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Multifuge 3 SR	Heraeus
RPMI 1640	LifeTechnologies	#11875085	500 mL
FCS	Pan Biotech #3302-P101102
聚苯乙烯圆底管	Falcon	#352054	5 mL
杜尔贝科磷酸盐缓冲液	Sigma	D8662
牛血清白蛋白	Roth	#8076.3
皂苷	Sigma	S7900
多聚甲醛	Sigma Aldrich	#16005
Speed Bead	Amnis	#400041
Minishaker MS1	IKA Works	MS1
微量滴定板	Greiner Bio One	#650101	96U
肠毒素SEB	Sigma Aldrich	S4881
DAPI	Sigma Aldrich	D9542	一千至三千比例
CD3-PeTxR	Invitrogen	MHCD0317	一比三十的比例
鬼笔环肽-AF647	分子探针	A22287	一比五十的比例
IS100	Amnis		成像流式细胞仪
IDEAS	Amnis		软件
激励	Amnis		软件