利用成像流式细胞术分析人T细胞与SEB负载的Raji细胞之间的免疫突触

摘要

来源：  Wabnitz, G. 等，利用成像流式细胞术对人类系统中免疫突触进行定性和定量分析。J. Vis. Exp. (2019)

该视频分析了未纯化的全白细胞制剂中T细胞之间免疫突触的形成 金黄色葡萄球菌 肠毒素B，SEB负载的Raji细胞。通过成像流式细胞术观察到免疫突触中CD3和F-肌动蛋白的富集。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 全白细胞的制备

1. 使用肝素化注射器从健康供体（或患者）抽取1 mL外周血。确保已获得相关伦理委员会对献血的批准。
2. 在50 mL离心管中，将1 mL人外周血与30 mL ACK裂解缓冲液（150 mM NH₄Cl、1 mM KHCO₃ 和 0.1 mM EDTA，pH 7.0）混合，并在室温下孵育8分钟。
3. 用PBS补满离心管，以300 x g 离心6分钟。吸除上清液，并将沉淀重悬于30 mL ACK裂解缓冲液中。
4. 重复步骤1.2和1.3，直至上清液澄清。最后用PBS洗涤细胞，于室温下以300 x g 离心6分钟，将细胞沉淀重悬于2 mL培养基（RPMI1640 + 10% FCS）中。将细胞在37 °C孵育60分钟。

2. 使用 SEB 负载 Raji 细胞

1. 准备两个15 mL Falcon离心管，每管中加入1.5 × 10⁶个Raji细胞。离心（300 × g，室温，6分钟），弃去上清液。
2. 将细胞重悬于残留培养基中（约50–100 µL），加入1.9 µL（1.9 µg）SEB，室温孵育15分钟。加入5 mL培养基，离心（300 × g，室温，6分钟），将细胞沉淀重悬于培养基（RPMI1640 + 10% FCS）中，调整细胞密度至1 × 10⁶ 个细胞/mL。

3. 免疫突触的诱导与染色方案

1. 将500 µL SEB负载的Raji细胞悬液加入一支FACS管中，另取500 µL未负载的Raji细胞悬液加入另一支FACS管中。每管加入650 µL泛白细胞悬液，离心沉淀细胞（300 × g，室温离心10分钟）。弃去上清液，将沉淀重悬于150 µL培养基（RPMI1640 + 10% FCS）中，37 °C孵育（通常为45分钟）。
2. 轻轻涡旋细胞（1,000 rpm，10秒），并在涡旋过程中加入1.5 mL 1.5%多聚甲醛以固定细胞。加入1 mL PBS + 1% BSA终止固定。离心收集细胞（300 × g 室温孵育10分钟后，将细胞沉淀重悬于1 mL PBS + 1% BSA中。
3. 沉淀（300 × g 室温孵育10分钟，然后在96孔U型板中用100 µL PBS + 1% BSA + 0.1%皂苷重悬细胞，室温孵育15分钟以透化细胞。
4. 用含1% BSA和0.1%皂苷的PBS洗涤细胞，离心（300 x g） g 室温孵育10分钟，然后将细胞沉淀重悬于50 µL含荧光标记抗体或化合物的PBS缓冲液（含1% BSA和0.1%皂苷）中，抗体包括CD3-PE-TxRed（1:30）、Phalloidin-AF647（1:150）和DAPI（1:3,000）。
5. 在室温避光条件下孵育细胞 30 分钟。加入 1 mL PBS + 1% BSA + 0.1% saponin 重悬细胞，洗涤 3 次。300 x g 离心 g 室温孵育10分钟。将细胞重悬于60 µL PBS中，用于成像流式细胞术检测。

使用流式细胞仪进行图像采集

注意：以下图像采集程序和数据分析基于使用如ImageStream（IS100）、INSPIRE和IDEAS等软件的成像流式细胞术。然而，也可使用其他流式细胞仪和分析软件。

1. 在连接成像流式细胞仪的计算机上打开分析软件，然后在“仪器”菜单中点击“初始化流路系统”。当提示时，将微球加入右侧进样口。
2. 从“文件”菜单中加载默认模板，然后点击“运行/设置”。在“视图”下拉菜单中选择“微球”。
3. 如果明场照明光源的指示值低于200，则点击“设置强度”以调节明场照明光源。
4. 在“辅助”选项卡中点击“全部开始”，运行校准和测试程序。
5. 点击“冲洗/锁定/加载”，当提示时将样品加入左侧进样口。将细胞加载到流式细胞仪后，打开“细胞分类器”并按以下参数进行调整：每个通道的峰值强度上限设为1,022，通道2（DAPI）和通道5（CD3-Pe-TxR）的峰值强度下限设为50，通道1（侧向散射）的面积下限设为50，上限设为1,500。
6. 在“设置”选项卡中，将激发激光功率调整为405 nm（15 mW）、488 nm（200 mW）和647 nm（90 mW）。
7. 在“视图”下拉菜单中切换“细胞”和“微球”，以评估细胞分类器和激光功率的调整效果。
   注意：通过调整细胞分类器和/或激发激光功率，确保所有单个细胞及成对细胞均出现在“细胞视图”中，而细胞团块、碎片以及像素饱和的图像均出现在“碎片视图”中。
8. 在“设置”选项卡中定义样品名称及需采集的图像数量（样品为15,000–25,000张，补偿对照为500张）。点击“运行/设置”以开始数据采集。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Multifuge 3 SR	Heraeus
RPMI 1640	LifeTechnologies	#11875085	500 mL
FCS	Pan Biotech #3302-P101102
聚苯乙烯圆底管	Falcon	#352054	5 mL
杜尔贝科磷酸盐缓冲液	Sigma	D8662
牛血清白蛋白	Roth	#8076.3
皂苷	Sigma	S7900
多聚甲醛	Sigma Aldrich	#16005
Speed Bead	Amnis	#400041
Minishaker MS1	IKA Works	MS1
微量滴定板	Greiner Bio One	#650101	96U
肠毒素SEB	Sigma Aldrich	S4881
DAPI	Sigma Aldrich	D9542	一千至三千比例
CD3-PeTxR	Invitrogen	MHCD0317	一比三十的比例
鬼笔环肽-AF647	分子探针	A22287	一比五十的比例
IS100	Amnis		成像流式细胞仪
IDEAS	Amnis		软件
激励	Amnis		软件