一种研究间充质干细胞调控巨噬细胞吞噬作用的检测方法

摘要

来源：Evans, J. F., 等. 间充质干细胞对巨噬细胞吞噬作用的调控；定量与成像. J. Vis. Exp. (2021)。

本视频展示了一种在共培养体系中研究间充质干细胞（MSC）调控巨噬细胞吞噬作用的实验方法。将MSC与巨噬细胞共培养后，加入与pH敏感型荧光染料偶联的非调理素化酵母聚糖颗粒，供巨噬细胞吞噬。随着吞噬作用增强，荧光强度上升，从而可测定MSC对吞噬活性的调控作用。

方案

注意：所有培养基制备和细胞培养操作均在超净生物安全柜的层流条件下进行，以确保无菌环境。所述的所有培养孵育步骤均在培养箱中进行，培养箱需维持 37 °C、5% CO₂ 和 95% 湿度的环境条件。

1. 细胞培养

1. 培养基的制备
   1. 对于间充质干细胞（MSC）和LADMAC细胞（小鼠骨髓来源的巨噬细胞；该名称源自建立该细胞系的研究人员Laskin、Dower和Malech的姓氏组合），在500 mL高糖DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基）中加入50 mL胎牛血清（FBS）和5 mL 100倍浓度的抗生素/抗真菌素混合液。
   2. 对于巨噬细胞（MΦ），在500 mL高糖DMEM中加入50 mL FBS、100 mL LADMAC条件培养基（按第1.2节步骤制备）以及5 mL 100倍浓度的抗生素混合液。
      注意：LADMAC细胞可产生集落刺激因子（CSF-1），该因子对支持MΦ细胞的生长至关重要。
2. 细胞扩增以准备共培养
   1. 为从冻存细胞中接种MSC和MΦ细胞，将第1.1节中配制的适当培养基各9 mL分别加入四个100 mm细胞培养皿（每种细胞类型各四个），于细胞培养箱中平衡15分钟。
   2. 同....

结果

图1：共培养与吞噬作用检测流程概览。 与MSC共培养条件下，对巨噬细胞（MΦ）吞噬活性进行定性和定量分析的实验流程示意图。

补充文件1：一次优化实验的原始动力学数据代表性电子表格文件。 请点击此处下载该文件。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
96孔黑色聚苯乙烯微孔板	MilliporeSigma	CLS3603-48EA
0.4% 台盼蓝溶液	MilliporeSigma	T8154-20ML
15 mL 和 50 mL 圆锥形无菌聚丙烯离心管	ThermoFisher	339653
抗生素-抗真菌剂（100X）Gibco	ThermoFisher	15240096
细胞刮刀	MilliporeSigma	CLS3008-100EA
培养瓶，组织培养处理，表面积 75 cm²，斜颈，带盖，带滤膜	MilliporeSigma	C7231-120EA
D1 ORL UVA [D1]	ATCC	CRL-12424	小鼠MSC细胞系
DMEM，高糖	ThermoFisher	11965092
胎牛血清，经鉴定，热灭活	ThermoFisher	16140071
血细胞计数板	FisherScientific	02-671-51B
I-11.15	ATCC	CRL-2470	小鼠MΦ细胞系
LADMAC细胞系	ATCC	CRL-2420	LADMAC细胞分泌集落刺激因子1（CSF-1）。
活细胞成像溶液	ThermoFisher	A14291DJ
PBS，pH 7.4	ThermoFisher	10010031
pH罗丹明绿-酵母聚糖生物颗粒偶联物	ThermoFisher	P35365
Spectramax i3X	Molecular Devices
无菌一次性真空过滤装置，250 mL，0.2 µm	ThermoFisher	568-0020
无菌注射器滤器，0.2 微米	ThermoFisher	723-2520
组织培养处理培养皿，100 mm × 20 mm	MilliporeSigma	CLS430167-100EA
胰蛋白酶-EDTA（0.05%），酚红	ThermoFisher	25300054