一种研究间充质干细胞调控巨噬细胞吞噬作用的检测方法

摘要

来源：Evans, J. F., 等. 间充质干细胞对巨噬细胞吞噬作用的调控；定量与成像. J. Vis. Exp. (2021)。

本视频展示了一种在共培养体系中研究间充质干细胞（MSC）调控巨噬细胞吞噬作用的实验方法。将MSC与巨噬细胞共培养后，加入与pH敏感型荧光染料偶联的非调理素化酵母聚糖颗粒，供巨噬细胞吞噬。随着吞噬作用增强，荧光强度上升，从而可测定MSC对吞噬活性的调控作用。

方案

注意：所有培养基制备和细胞培养操作均在超净生物安全柜的层流条件下进行，以确保无菌环境。所述的所有培养孵育步骤均在培养箱中进行，培养箱需维持 37 °C、5% CO₂ 和 95% 湿度的环境条件。

1. 细胞培养

1. 培养基的制备
   1. 对于间充质干细胞（MSC）和LADMAC细胞（小鼠骨髓来源的巨噬细胞；该名称源自建立该细胞系的研究人员Laskin、Dower和Malech的姓氏组合），在500 mL高糖DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基）中加入50 mL胎牛血清（FBS）和5 mL 100倍浓度的抗生素/抗真菌素混合液。
   2. 对于巨噬细胞（MΦ），在500 mL高糖DMEM中加入50 mL FBS、100 mL LADMAC条件培养基（按第1.2节步骤制备）以及5 mL 100倍浓度的抗生素混合液。
      注意：LADMAC细胞可产生集落刺激因子（CSF-1），该因子对支持MΦ细胞的生长至关重要。
2. 细胞扩增以准备共培养
   1. 为从冻存细胞中接种MSC和MΦ细胞，将第1.1节中配制的适当培养基各9 mL分别加入四个100 mm细胞培养皿（每种细胞类型各四个），于细胞培养箱中平衡15分钟。
   2. 同时，将含有10⁶个冻存细胞的冻存管置于37 °C水浴中快速解冻2–3分钟，直至刚好完全融化。随后，将解冻后的MSC细胞加入9 mL新鲜MSC培养基中，将解冻后的MΦ细胞加入9 mL新鲜MΦ培养基中，分别置于15 mL或50 mL无菌锥形离心管中，并在水平转子离心机中以125 × g离心5分钟。
   3. 吸除或倾倒上清液，用移液器轻轻吹打，将每管细胞沉淀重悬于4 mL相应的新鲜培养基中。然后，取1 mL细胞悬液分别加入已在第1.2.1步中完成平衡的四个100 mm培养皿（每种细胞类型各四个）中。
   4. 将含细胞的培养皿放回培养箱中，每2–3天更换一次培养基，直至细胞融合度达到70%–80%。

2. 在实验培养皿中接种MSC，第1天

注意：在接种间充质干细胞（MSC）之前，需设计用于荧光分光光度法检测的96孔板布局以及用于动态成像的腔室载玻片布局。对于96孔板，应在实验孔周围设置含有细胞的边缘孔，但这些边缘孔不参与后续检测。至少标记四个孔作为试剂空白对照（RBL）。96孔板布局示例见表1，4孔腔室载玻片布局示例见表2。建议使用底部透明的黑色或白色96孔板。1.5 mm硼硅酸盐玻璃材质的腔室载玻片为最佳选择，但腔室数量可根据研究设计进行调整。后续方法的流程图汇总见图1。

1. 当细胞融合度达到70%-80%时，从100 mm培养皿中吸除生长培养基，并加入5 mL磷酸盐缓冲液（PBS）以分离间充质干细胞（MSC）。
2. 吸去 PBS，加入 2 mL 0.05% 胰蛋白酶/EDTA（乙二胺四乙酸），置于培养箱中孵育 3–5 分钟。
3. 3分钟后，使用倒置显微镜检查细胞脱落情况。若细胞已脱落，则进行下一步操作；若未脱落，继续孵育1-2分钟。孵育时间不得超过5-6分钟。
4. 向含有脱离细胞的培养皿中加入5 mL新鲜培养基。用胰蛋白酶/培养基混合液冲洗培养皿，并使用无菌刻度移液管将细胞收集至一个洁净、无菌的50 mL锥形管中。
5. 离心5分钟，125 × g g吸弃上清液，然后用移液器轻轻吹打，将细胞沉淀重悬于10 mL新鲜培养基中。
6. 为计数细胞，加入10 µ将30微升细胞悬液加入 µ0.4% 台盼蓝溶液 L 加入 1.5 mL 微量离心管中，然后用移液器吸取 10 µ在血细胞计数板盖玻片下加入混合液L。
7. 使用倒置显微镜或明场显微镜，以10倍物镜计数四个1 mm区域中未染色（有活力）的细胞² 方格。使用公式计算细胞数量：cells/mL = 细胞计数 / #1 mm² 平方 × 稀释因子 × 10⁴.
   注意： 以本示例为例，1 mm 的数量² 计数的方格数为4，稀释倍数为4。
8. 使用公式 C₁V₁ = C₂V₂ 用于计算并配制 1 × 10⁵ 每毫升细胞悬液。根据板的设计，每填充一个96孔板的孔需准备1 mL细胞悬液，每填充一个4孔板腔室需准备0.75 mL细胞悬液。
   注意： C₁ = 细胞计数，V₁ = 正在计算的内容，C₂ = 1 × 10⁵，V₂ = 5.50 mL
9. 测定 V₁，并从所需的总体积5.50 mL中减去该体积，以确定配制悬浮液所需的新鲜培养基体积。加入细胞体积（V₁) 从原始悬液中移取至新鲜培养基中，总体积为 5.50 mL，含 1 x 10⁵ cells/mL
10. 加入100 µL，1 × 10⁵ 根据96孔板的设计，使用多通道微量移液器将细胞/mL悬浮液加入每孔，共530 µ使用微量移液器根据板的设计向腔室载玻片的每个孔中加入 L。孵育过夜。
    注意： 在此实验中，将间充质干细胞接种于96孔板的第1、2、3和6列表1以及4孔板的第1和第2孔表2）。因此，至少需要5.50 mL的1 × 10⁵ 细胞/mL 悬液被制备。MΦ 在实验板中接种间充质干细胞的当天，当细胞融合度达到80%时，用炎症介质处理。

3. 分离MΦ 并准备共培养，第2天

1. 移除MΦ细胞中的激活培养基，并加入5 mL新鲜生长培养基。用细胞刮轻轻刮取细胞，收集至50 mL锥形管中。
2. 使用台盼蓝排斥法和血细胞计数板对细胞进行计数，方法同MSC计数步骤2.6–2.7所述。
3. 根据步骤2.8–2.9中的公式，分别制备浓度为2 × 10⁵ cells/mL的两种细胞悬液：一种来自对照组MΦ培养物，另一种来自处理组MΦ培养物。
   注意：根据板式设计，每填充96孔板的一列需准备1 mL细胞悬液，每填充4孔板的一个腔室需准备0.75 mL细胞悬液。
4. 轻轻吸除含MSC的96孔板实验孔中的培养基。使用多通道移液器，根据板式设计，向相应的实验孔中加入100 µL处理组和对照组MΦ细胞悬液（有或无MSC）。置于培养箱中过夜培养。
5. 轻轻吸除含MSC的4孔板中的培养基，使用移液器根据实验设计向相应孔中加入530 µL MΦ细胞悬液。置于培养箱中过夜培养。

4. 吞噬作用检测，动力学荧光96孔板读数，第3天

1. 设定检测参数
   1. 在检测当天，打开荧光酶标仪，并通过计算机将系统温度设置为 37 °C。
   2. 启动 System Pro 软件，检查左上角的仪器图标，确认仪器是否已与计算机连接。如果显示带斜线的红色圆圈，请点击仪器图标，并在弹出窗口中选择相应仪器以建立连接。
   3. 选择新建实验，进入微孔板设置助手弹出窗口。在微孔板设置助手菜单中，选择配置采集设置。
   4. 在设置菜单中选择单色器作为光学配置，读取模式选择FL（荧光），读取类型选择动力学。
   5. 在同一配置窗口中，点击类别下的波长，然后将激发带宽设为 9 nm，发射带宽设为 15 nm。
   6. 将波长对数量设为 1。将LM1波长设为激发 510 nm，发射 540 nm。
   7. 继续浏览其他类别，接下来选择板类型，并选择与所用微孔板类型匹配的选项。
      注意：所选板类型必须与实际使用的一致，系统将根据该选择自动设定读数高度。
   8. 接着选择读取区域，并高亮标出实验设计中所使用的 96 孔板区域。
   9. 选择PMT 和光学元件，将 PMT 增益设为高，每次读数闪光次数设为6。若使用透明底板，请勾选从底部读取选项。
   10. 选择定时，设定为在 70 分钟内每 10 分钟读取一次。
   11. 选择振荡，勾选首次读取前，设定时间为 5 秒；勾选读取间隔，设定时间为 3 秒。将两种振荡的强度均设为低，振荡模式设为线性。
   12. 关闭窗口。当微孔板设置助手窗口再次弹出时，选择配置微孔板布局。高亮微孔板设计中的BL孔，然后点击板空白。
   13. 依次高亮每个实验组的行，点击添加，命名该组，并选择一种颜色。
   14. 在微孔板设计下方的分配选项中，选择系列，然后在弹出窗口中定义系列并点击确定。对每组重复此操作。
2. 制备酵母聚糖悬浮液
   1. 在等待系统温度升至 37 °C 的过程中，将 1 mg 酵母聚糖颗粒重悬于 5 mL 活细胞成像培养基中。
      1. 向含有颗粒的小瓶中加入 1 mL 活细胞成像培养基，将颗粒转移至玻璃培养管中。再用额外 1 mL 成像溶液冲洗小瓶，并将冲洗液转移至同一玻璃管中，以确保所有颗粒均被转移。再加入 3 mL 成像溶液，最终获得浓度为 0.2 mg/mL 的颗粒悬浮液。
   2. 用涡旋振荡器快速脉冲振荡 30–60 秒，然后使用探头式超声仪进行 60 次快速超声处理。
      注意：必须制备均匀的颗粒悬浮液，并避免在加入实验孔前长时间静置，因为颗粒会迅速重新聚集。每细胞颗粒密度可能需要根据所用 MΦ 的来源、处理方式和密度进行优化。本研究中使用的是偶联酵母聚糖颗粒，但偶联的E. coli和S. aureus颗粒也可获得。
3. 加入酵母聚糖并读取微孔板
   1. 吸除实验孔中的培养基，用 100 µL 活细胞成像溶液冲洗一次。同样用活细胞成像溶液冲洗 RBL 孔。
   2. 吸除实验孔和 RBL 孔中的活细胞成像溶液，替换为 100 µL 酵母聚糖颗粒悬浮液。
   3. 通过触摸屏界面打开荧光酶标仪的微孔板托盘。将微孔板（不带盖）放入托盘中，确保 A1 孔位于左上角。关闭托盘后，点击顶部菜单中的绿色读取按钮。
   4. 读取完成后，将文件保存至指定文件夹，并通过点击文件选择导出，将数据导出为电子表格格式。
   5. 在电子表格（补充文件 1）中计算每个重复组在各时间点（10 分钟、20 分钟、30 分钟等）的平均值 ± 标准误（SEM）相对荧光值，并将数据导入绘图软件。
   6. 采用折线图形式展示数据，使用双因素方差分析（时间 × 处理/间充质干细胞为因素），随后进行 Tukey 多重比较检验，以确定各组间的差异。
      注意：在 96 孔板读取过程中，应同时准备用于延时成像的动态成像板，并确保动态成像按顺序逐个分析实验孔。

表1：96孔板设计示例。 CBL - 细胞空白孔；MSC - 第1天接种细胞；MΦ+ - 第2天接种并用药物处理的巨噬细胞，MΦ未处理 - 第2天接种但未用药物处理的巨噬细胞；RBL - 第3天检测时加入试剂空白孔。

	1	2	3	4	5	6	7
A	CBL	MSC/MΦ	MSC/MΦ+	MΦ	MΦ+	CBL	RBL
B	CBL	MSC/MΦ	MSC/MΦ+	MΦ	MΦ+	CBL	RBL
C	CBL	MSC/MΦ	MSC/MΦ+	MΦ	MΦ+	CBL	RBL
D	CBL	MSC/MΦ	MSC/MΦ+	MΦ	MΦ+	CBL	RBL
E	CBL	MSC/MΦ	MSC/MΦ+	MΦ	MΦ+	CBL	RBL
F	CBL	MSC/MΦ	间充质干细胞/男性Φ+	MΦ	MΦ+	CBL	RBL
G	CBL	MSC/MΦ	MSC/MΦ+	MΦ	MΦ+	CBL	RBL
H	CBL	MSC/MΦ	MSC/MΦ+	MΦ	MΦ+	CBL	RBL

表2：4孔板设计示例。 MSC——第1天接种；MΦ+ 处理组与未处理MΦ第2天接种。

1	2	3	4
MSC/MΦ	MSC/MΦ+	MΦ	MΦ+

结果

图1：共培养与吞噬作用检测流程概览。 与MSC共培养条件下，对巨噬细胞（MΦ）吞噬活性进行定性和定量分析的实验流程示意图。

补充文件1：一次优化实验的原始动力学数据代表性电子表格文件。 请点击此处下载该文件。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
96孔黑色聚苯乙烯微孔板	MilliporeSigma	CLS3603-48EA
0.4% 台盼蓝溶液	MilliporeSigma	T8154-20ML
15 mL 和 50 mL 圆锥形无菌聚丙烯离心管	ThermoFisher	339653
抗生素-抗真菌剂（100X）Gibco	ThermoFisher	15240096
细胞刮刀	MilliporeSigma	CLS3008-100EA
培养瓶，组织培养处理，表面积 75 cm²，斜颈，带盖，带滤膜	MilliporeSigma	C7231-120EA
D1 ORL UVA [D1]	ATCC	CRL-12424	小鼠MSC细胞系
DMEM，高糖	ThermoFisher	11965092
胎牛血清，经鉴定，热灭活	ThermoFisher	16140071
血细胞计数板	FisherScientific	02-671-51B
I-11.15	ATCC	CRL-2470	小鼠MΦ细胞系
LADMAC细胞系	ATCC	CRL-2420	LADMAC细胞分泌集落刺激因子1（CSF-1）。
活细胞成像溶液	ThermoFisher	A14291DJ
PBS，pH 7.4	ThermoFisher	10010031
pH罗丹明绿-酵母聚糖生物颗粒偶联物	ThermoFisher	P35365
Spectramax i3X	Molecular Devices
无菌一次性真空过滤装置，250 mL，0.2 µm	ThermoFisher	568-0020
无菌注射器滤器，0.2 微米	ThermoFisher	723-2520
组织培养处理培养皿，100 mm × 20 mm	MilliporeSigma	CLS430167-100EA
胰蛋白酶-EDTA（0.05%），酚红	ThermoFisher	25300054