通过电穿孔法将细菌效应蛋白导入哺乳动物细胞

摘要

来源：Sontag, R. L. 等，将功能性细菌效应蛋白电穿孔导入哺乳动物细胞。J. Vis. Exp. (2015)

在本视频中，我们演示了通过电穿孔法将细菌效应蛋白导入哺乳动物细胞。经特异性荧光染料标记的抗体染色后，利用共聚焦显微镜检测细菌效应蛋白在细胞内的定位。

方案

1. 电穿孔

1. 将400 µl细胞悬液加入预冷的电转杯中，并向电转杯中加入20 µg选定的蛋白质（终浓度为50 µg/ml）。
2. 轻轻弹动电转杯约10次以混匀，避免损伤细胞。注意：也可将电转杯轻轻倒置数次以充分混匀，但切勿使用移液器反复吹打或涡旋，以免损伤细胞。
3. 用纸巾或其他擦拭材料将电转杯外壁擦干，以防止电穿孔仪中发生电弧现象。
4. 在0.3 kV条件下对样品进行电穿孔，持续1.5–1.7 msec。注意：本研究中通常采用此参数。
5. 电穿孔后立即轻轻弹动电转杯约10次，以充分混匀。

2. 细胞接种

1. 将电穿孔后的细胞置于冰上保存，直至准备转移至恢复培养板。
2. 对于大多数下游分析，用预热的NGM洗涤细胞1次，以去除多余的效应蛋白。
   1. 移除细胞用于分析，并重悬于3-5 ml NGM中。
   2. 以 900 × g 离心 4 分钟，沉淀细胞。
   3. 用适量的NGM重悬，以适应所需平板大小（例如， 2 ml（用于35 mm培养皿）。
3. 移除适量细胞用于后续分析。
   1. 示....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液	Cellgro	25-050-Cl
0.4 cm 间隙一次性电穿孔比色皿	Bio-Rad	165-2088
100% 甲醇	Any	N/A	易燃，有毒
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma-Aldrich	A4919
细胞计数装置 — 血细胞计数板或库尔特计数器	Beckman Coulter	Model Z1
细胞培养孵育箱	Any	N/A	37 °C，含 95% 空气和 5% CO₂ 的湿润环境
细胞培养塑料器皿	Any	N/A	细胞培养瓶/板、移液管、离心管、橡胶刮刀
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Cellgro	10-013	预热至 37 °C
电穿孔仪	Bio-Rad	E. coli Pulser
胎牛血清（FBS）	Cellgro	35-016-CV
荧光共聚焦显微镜	Ziess	Model LSM 710
显微镜用玻璃底培养皿	Wilco Wells	HBSt-3522
HeLa 细胞系	ATCC	ATCC CCL-2
最低必需培养基（MEM）	Cellgro	10-010	预热至 37 °C
其他荧光染料（WGA、DAPI）与抗荧光淬灭剂联用	Any	N/A
青霉素/链霉素	Cellgro	30-002-Cl
RAW 264.7 细胞系	ATCC	TIB-71
针对目标蛋白的一抗	Any	N/A
与荧光染料偶联的二抗	Any	N/A
磷酸盐缓冲液	Any	N/A	冷却至 4 °C
无菌磷酸盐缓冲液	Any	N/A	预热至 37 °C
可容纳锥形管的台式离心机（推荐摆桶式转子）	Any	N/A
吐温 X-100	Sigma-Aldrich	T8585	刺激性，有毒