通过电穿孔法将细菌效应蛋白导入哺乳动物细胞

摘要

来源：Sontag, R. L. 等，将功能性细菌效应蛋白电穿孔导入哺乳动物细胞。J. Vis. Exp. (2015)

在本视频中，我们演示了通过电穿孔法将细菌效应蛋白导入哺乳动物细胞。经特异性荧光染料标记的抗体染色后，利用共聚焦显微镜检测细菌效应蛋白在细胞内的定位。

方案

1. 电穿孔

1. 将400 µl细胞悬液加入预冷的电转杯中，并向电转杯中加入20 µg选定的蛋白质（终浓度为50 µg/ml）。
2. 轻轻弹动电转杯约10次以混匀，避免损伤细胞。注意：也可将电转杯轻轻倒置数次以充分混匀，但切勿使用移液器反复吹打或涡旋，以免损伤细胞。
3. 用纸巾或其他擦拭材料将电转杯外壁擦干，以防止电穿孔仪中发生电弧现象。
4. 在0.3 kV条件下对样品进行电穿孔，持续1.5–1.7 msec。注意：本研究中通常采用此参数。
5. 电穿孔后立即轻轻弹动电转杯约10次，以充分混匀。

2. 细胞接种

1. 将电穿孔后的细胞置于冰上保存，直至准备转移至恢复培养板。
2. 对于大多数下游分析，用预热的NGM洗涤细胞1次，以去除多余的效应蛋白。
   1. 移除细胞用于分析，并重悬于3-5 ml NGM中。
   2. 以 900 × g 离心 4 分钟，沉淀细胞。
   3. 用适量的NGM重悬，以适应所需平板大小（例如， 2 ml（用于35 mm培养皿）。
3. 移除适量细胞用于后续分析。
   1. 示例1：将样品接种至玻璃底培养皿中，用于显微镜分析。
   2. 示例2：将细胞接种至细胞培养级塑料器皿中，用于蛋白质分析，例如亲和纯化。
4. 让细胞在加湿的95%空气/5% CO₂环境中平衡的培养板中恢复₂ 37°C 气氛中孵育至少 4 小时。

3. 显微镜分析

1. 固定/免疫荧光染色
   1. 在4小时恢复期后，用无菌PBS洗涤细胞1次。
   2. 用100%甲醇在室温下固定细胞2分钟。使用足量甲醇完全覆盖细胞（例如，35 mm培养皿使用2 ml）。
   3. 用无菌PBS洗涤3次。
   4. 用含0.4% Triton X-100的PBS溶液透化细胞15分钟。例如，直径35 mm的培养板使用1 ml。
      1. 根据目标蛋白的抗原表位及其定位调整透化时间和Triton X-100浓度。注意：每种靶标的最佳条件需通过实验确定，但上述条件适用于大多数胞质内靶标。
   5. 用含5%牛血清白蛋白（BSA）的PBS溶液在室温下封闭1小时。例如，直径35 mm的培养板使用1 ml。
   6. 用PBS洗涤3次。
   7. 将一抗加入抗体结合液（含0.1% Triton X-100和1% BSA的PBS溶液）中，4 °C轻柔振荡孵育过夜。例如，直径35 mm的培养板使用0.5 ml。
      1. 按照抗体生产商推荐的比例进行稀释。注意：例如，链霉亲和素结合肽标签（SBP-tag）抗体按1:1,000稀释，而PKN1抗体按1:200稀释。
   8. 用PBS洗涤4次。
   9. 在抗体结合液中加入合适的荧光标记二抗，室温避光孵育1小时。
      1. 例如，在室温下使用Alexa 488或Alexa 647孵育1小时。
         1. 按照抗体生产商推荐的比例进行稀释（例如，本研究中约为1:1,000）。
      2. 根据需要添加其他染料，例如，在室温下加入5 μM与Alexa 647偶联的小麦胚芽凝集素（WGA）或按生产商推荐使用DAPI，孵育1小时。
   10. 用PBS洗涤5次，避光保存于4 °C，待成像时取出使用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.25% 胰蛋白酶-EDTA 溶液	Cellgro	25-050-Cl
0.4 cm 间隙一次性电穿孔比色皿	Bio-Rad	165-2088
100% 甲醇	Any	N/A	易燃，有毒
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma-Aldrich	A4919
细胞计数装置 — 血细胞计数板或库尔特计数器	Beckman Coulter	Model Z1
细胞培养孵育箱	Any	N/A	37 °C，含 95% 空气和 5% CO₂ 的湿润环境
细胞培养塑料器皿	Any	N/A	细胞培养瓶/板、移液管、离心管、橡胶刮刀
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Cellgro	10-013	预热至 37 °C
电穿孔仪	Bio-Rad	E. coli Pulser
胎牛血清（FBS）	Cellgro	35-016-CV
荧光共聚焦显微镜	Ziess	Model LSM 710
显微镜用玻璃底培养皿	Wilco Wells	HBSt-3522
HeLa 细胞系	ATCC	ATCC CCL-2
最低必需培养基（MEM）	Cellgro	10-010	预热至 37 °C
其他荧光染料（WGA、DAPI）与抗荧光淬灭剂联用	Any	N/A
青霉素/链霉素	Cellgro	30-002-Cl
RAW 264.7 细胞系	ATCC	TIB-71
针对目标蛋白的一抗	Any	N/A
与荧光染料偶联的二抗	Any	N/A
磷酸盐缓冲液	Any	N/A	冷却至 4 °C
无菌磷酸盐缓冲液	Any	N/A	预热至 37 °C
可容纳锥形管的台式离心机（推荐摆桶式转子）	Any	N/A
吐温 X-100	Sigma-Aldrich	T8585	刺激性，有毒