马拉色菌诱导的小鼠模型皮肤炎症及真菌负荷分析

摘要

来源：Sparber, F. 等人， 感染小鼠 马拉色菌 spp. 用于研究真菌-宿主相互作用。 视频实验杂志 (2019)

本视频演示 马拉色菌小鼠中由...诱导的皮肤感染 马拉色菌 将油性悬液涂抹于受伤的耳部，诱发耳组织的炎症与肿胀。随后取耳组织进行解剖、匀浆处理，并接种至琼脂平板培养。菌落数量反映皮肤炎症所致的真菌负荷。

方案

所有涉及动物模型的操作均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 培养 马拉色菌 在实验室条件下

注意：除非另有说明，本方案中使用的所有试剂和培养基均应储存在室温（RT，20 – 25 °C）下，因为较低温度可能抑制真菌生长。

1. 制备液体改良Dixon（mDixon）培养基 马拉色菌 生长。配制500 mL液体mDixon培养基时，将18 g麦芽提取物、10 g脱水牛胆汁、5 mL Tween-40、3 g蛋白胨、1 mL甘油和1 mL油酸溶解于500 mL蒸馏H₂O (dH₂O）。用 HCl 将培养基 pH 值调至 6，然后高压灭菌。将培养基在室温下保存。
2. 在高压灭菌前，将7.5 g琼脂加入500 mL mDixon培养基中，制备mDixon琼脂平板。高压灭菌后，使用搅拌棒和磁力加热板缓慢冷却mDixon琼脂，以避免培养基在冷却过程中局部凝固。
3. 待琼脂冷却至 50 – 60 °C 后，在超净工作台中将液体分装至培养皿中，并于室温下静置过夜使其干燥。
   注意： 琼脂平板在包裹后倒置存放于4 °C，可保存数周以避免蒸发。
4. 获取 马拉色菌 分离并复苏冻干保存的菌种 马拉色菌 根据供应商提供的说明进行操作。
5. 在无菌的 100 mL 三角瓶中加入 10 mL 液体 mDixon 培养基，并接种复苏后的菌种 马拉色菌 按照试剂提供商的说明制备悬浮液。将培养物置于30 °C、180 rpm的摇床培养箱中孵育。
6. 观察生长情况 马拉色菌 定期观察培养物的颜色和浑浊度，以监测其生长情况，通常表现为乳白色和浑浊。生长动力学取决于细菌的种类和菌株。 马拉色菌 在某些情况下可能特别缓慢 马拉色菌 是从冻干菌种新近复苏的。图1A).
7. 通过将3份浓密培养的菌液与1份无菌甘油混合制备甘油菌种保存液 马拉色菌 在 mDixon 培养基中培养，加入1份无菌99%甘油。分装 马拉色菌将甘油混合物加入无菌螺口管中，并于 -80 °C 保存。
8. 用于体外扩增，接种于培养板 马拉色菌属 使用接种环将mDixon液体培养物或冻存的甘油菌种（从4 °C取出并恢复至室温）接种至mDixon琼脂平板上。
   注意： 从4 °C将mDixon琼脂平板转移至室温后再使用，因为低温的mDixon琼脂会抑制真菌生长。
9. 孵育琼脂平板 马拉色菌 倒置于30 °C的恒温培养箱（不振荡）中培养。观察菌体生长情况 马拉色菌 定期观察菌落。
   注意： 马拉色菌 mDixon 琼脂平板上的菌落在 3 至 5 天内出现，呈乳白色、无光泽、表面光滑，凸起状图1B).
10. 储存 马拉色菌属 在室温下培养 mDixon 琼脂平板上的菌落约 2 周。随后，通过划线法接种制备新的 mDixon 琼脂平板 马拉色菌 从冻存的甘油菌种中复苏，具体步骤如1.7所述。

2. 实验用接种物的制备 马拉色菌 小鼠感染

1. 在无菌的100 mL锥形瓶中，加入10 mL液体mDixon培养基，并接种3–5个单菌落 马拉色菌 来自 mDixon 琼脂平板的菌落（见步骤 1， 图1B).
2. 孵育 马拉色菌 在30 °C、180 rpm条件下培养约48至96小时，直至培养物呈乳白色且浑浊（图1A).
   注意： 完成所需的时间 马拉色菌 生长依赖于 马拉色菌 物种和菌株以及用于接种的真菌量。
3. 转移2 mL的 马拉色菌 将培养物转移至一支无菌的2 mL微量离心管中，在10,000 ×g条件下离心1分钟 x g。
4. 弃去上清液，加入1 mL磷酸盐缓冲液（PBS）重悬沉淀。再次于10,000 ×g离心1分钟 x g.
5. 洗涤后，用移液器剧烈吹打将沉淀重悬于1 mL PBS中，并在600 nm处测定溶液的光密度（OD600）。_A600）使用分光光度计进行测定。稀释 马拉色菌 用 PBS 将悬浮液稀释 20–50 倍以进行 OD 测定，确保读数在 0.1 至 1 之间。
   注意： 3天培养物的密度 马拉色菌 通常在15至30 OD之间变化_A600，取决于 马拉色菌 物种和菌株以及用于接种培养物的酵母细胞数量（步骤 2.1）。 马拉色菌 tends to form aggregates，因此，必须进行剧烈的吹打以确保悬液的均匀性。
6. 分装一定体积的 马拉色菌 PBS 悬浮液，其密度对应于 4 OD_A600 加入无菌的2 mL离心管中。每个待感染动物准备1管。
7. 离心含有 马拉色菌 10,000 × g 离心 1 分钟。
8. 弃去上清液，重悬沉淀 马拉色菌 在200 µL天然橄榄油中重悬沉淀（相当于2 OD）_A600 酵母细胞/100 µl 橄榄油.
   注意： 橄榄油被发现是经表皮感染的一种良好载体 马拉色菌，作为 马拉色菌 是一种亲脂性且依赖脂质的酵母。与PBS相比，橄榄油更易被皮肤吸收。但需注意，其悬浮并不容易 马拉色菌属 在橄榄油中。改善 马拉色菌通过涡旋振荡制备橄榄油悬浮液。将悬浮液于室温保存，直至用于感染实验。
9. 为对照组动物的模拟感染准备仅含橄榄油的试管。

3. 感染小鼠 马拉色菌

1. 订购6至8周龄的雌性C57BL/6小鼠，并在实验动物设施中适应至少一周。每组准备3至5只小鼠，包括一个未感染的对照组。
2. 配制无菌麻醉混合液，其中含1.3 mg/mL 塞拉嗪（Xylazine）和6.5 mg/mL 氯胺酮（Ketamine），溶于PBS中。5 mL麻醉混合液足以麻醉20只动物。根据需麻醉动物的数量调整混合液的体积。
   1. 通过腹腔注射方式给予每克体重10 µL的麻醉混合液（相当于每千克体重65 mg氯胺酮和13 mg塞拉嗪），将麻醉后的小鼠置于37 °C加热垫上。
      注意：在上述剂量下，动物通常可维持麻醉状态约30至60分钟。
3. 使用镊子轻夹后肢足部以检查反射，确认动物已完全麻醉。
4. 在眼睛表面涂抹眼用软膏，防止麻醉期间角膜脱水。
5. 可选：使用测厚规（量程0 - 5 mm）测量双耳耳廓厚度。每只耳朵测量两个不同区域，并计算每耳的平均耳厚。
   注意：耳厚测量为可选步骤，取决于具体研究问题。但如果将耳厚作为皮肤炎症的检测指标，则必须在感染前测量基础耳厚（见步骤4）。
6. 可选：通过轻微胶带剥离法破坏耳背部表皮屏障：手动将一小段胶带贴附于皮肤并撕下，重复5次，每次使用新的胶带。
   注意：Malassezia在表皮屏障受损的皮肤上诱发的皮肤炎症比完整皮肤更为显著（图2A）。
7. 使用无菌移液器将100 µL（OD_A600为2）的Malassezia/橄榄油悬液局部涂抹于每只耳朵的背侧。设置仅使用橄榄油处理的对照组（溶剂对照组）。
   注意：在涂抹前应剧烈涡旋振荡Malassezia/橄榄油悬液，以确保Malassezia均匀悬浮。
8. 将麻醉后的小鼠留在加热垫上，防止低体温，直至出现恢复迹象（如胡须运动、呼吸频率增加等）。
9. 向颈背部皮下注射200 µL无菌预温的2%葡萄糖溶液，以支持其代谢和再水化。
   注意：配制无菌2%葡萄糖溶液的方法为：将1 mg葡萄糖溶解于50 mL PBS中，并使用0.2 µm滤器过滤。溶液可在4 °C保存。
10. 将动物放回其笼具中。

4. 分析 马拉色菌诱导的皮肤炎症

注意：本方案描述了感染期间由马拉色菌（Malassezia）诱导的耳部肿胀分析方法，该指标可用于评估皮肤炎症程度。在进行胶带剥离和/或感染前（步骤 3.5），必须测量耳部基础厚度，这是分析真菌诱导耳部肿胀的前提条件。

1. 为感染Malassezia的动物及对照动物准备异氟烷麻醉室，用于短期麻醉。
2. 每次将一只动物转移至麻醉室中，并等待其完全麻醉。
   注意： 正确麻醉的体征包括全身完全放松以及缓慢而深的（侧腹）呼吸。需密切监测麻醉状态，因长时间暴露于异氟烷可能致命。
3. 将动物从麻醉室中取出，并放置于组织表面。
4. 使用千分尺（量程 0 - 5 mm）测量耳部厚度。对每只耳朵的两个不同区域进行测量，并计算每只耳朵的平均厚度（见步骤 3.5）。
5. 将动物放回笼中。
   注意： 异氟烷麻醉作用持续时间极短，动物在离开异氟烷麻醉室后约 30 秒内即可恢复。
6. 通过从感染后各时间点测得的耳部平均厚度中减去感染前（胶带剥离和/或感染前）测得的基线平均耳厚，计算耳部厚度的增加量。
7. 将计算所得数值绘制成耳部厚度增加量随时间变化的曲线，或 alternatively 绘制每只动物或每组动物的总耳部厚度随时间变化的曲线（图 2B）。

5. 检测感染皮肤中的真菌负荷

1. 为每只待取材的耳朵准备一个无菌的2 mL 微离心管，管内含0.5 mL 无菌的0.05% Nonidet P40 (NP40) 溶液（溶于dH₂O）₂O 和一个已灭菌的钢球（直径 5 mm）。
2. 使用精密天平称量离心管，并记录精确重量。
3. 通过 CO 气体安乐死小鼠₂ 窒息
4. 在基部切除耳组织，转移至含有 0.5 mL 无菌 dH 中 0.05% NP40 的离心管中₂O，如步骤 5.1 - 5.2 中所述。
5. 称量装有耳组织的离心管，通过从含组织的管重减去空管重量，计算每个样品的实际重量。
6. 使用组织匀浆器在25 Hz条件下匀浆耳组织6分钟。确保组织充分匀浆。
7. 将每种样本各100 µL（相当于每份匀浆液的1/5，稀释倍数=5）涂布于mDixon琼脂平板上，倒置平板于30°C培养箱中培养。
   注意： 根据预期的真菌载量调整接种的匀浆液量。确保接种足量的匀浆液，使每平板获得至少10个但不超过250个菌落，以便于准确计数。可选地，每个样本可接种多个平板，使用不同稀释度的匀浆液。
8. 检查生长情况 马拉色菌 定期观察菌落。
   注意： 菌落通常在2至3天后变得可见。所需时间 马拉色菌 菌落生长所需时间取决于物种和菌株 马拉色菌.
9. 统计每块平板上的菌落数。
10. 使用以下公式计算每克组织中的菌落形成单位数（CFU/g 组织）：
    CFU/g 组织 =（平板上菌落数）×（稀释倍数）/（皮肤样本重量，单位为 g）。
    注意： 最低检测限的近似值可通过以下公式进行评估：最低检测限 = （每平板1个菌落）×（稀释倍数）/（所有皮肤样本的平均重量，单位为g）。
11. 真菌载量通常以对数尺度绘制图 2C).

结果

图 1：马拉色菌的体外培养。（A）M. sympodialis 菌株 ATCC 42132 在 30 °C、180 rpm 条件下于液体 mDixon 培养基中培养 3 天（左侧），右侧为未接种的 mDixon 培养基对照三角瓶。（B）M. sympodialis 菌株 ATCC 42132 在 mDixon 琼脂平板上于 30 °C 培养 5 天后的菌落形态。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂	Sigma-Aldrich	A1296-1KG
异氟烷（Attane Isoflurane）	Piramal Healthcare	-
生物安全柜（BSC）Faster Ultra Safe	DASIT GROUP	TEC 5594	BSL2 认证
离心机	Eppendorf	5415D	兼容 2 ml Eppendorf 离心管
脱水牛胆汁	Sigma-Aldrich	70168-100G
Eppendorf 离心管（2 ml）	Eppendorf	0030 120.094
葡萄糖	Sigma-Aldrich	49159-5KG
甘油（99 %）	Honeywell	10314830
加热垫	Eickenmeyer	648048
孵育箱 Heraeus B20	Heraeus	412047753	BSL2 认证
赛拉嗪（Ketasol，100 mg）	Graeub AG	6680416
磁力加热板 MR Hei-Standard	Heidolph Instruments	442-1355
马拉色菌 spp.	ATCC	14522, 14521, 42132
麦芽提取物	Sigma-Aldrich	70167-500G
多联生物样本管（200 µl）	Sarstedt AG	7084211	Safelock
特级初榨橄榄油	-	-	市售可得
Nonidet P40	Axon Lab	A1694,0250
Oditest 测量装置	Kroeplin	S0247	量程 0–5 mm
油酸	Sigma-Aldrich	75090-5ML
蛋白胨	Oxoid	LP0037
培养皿	Sarstedt AG	82.1473
磷酸盐缓冲液（PBS，1×）	Amimed/Bioconcept	3-05F39
速眠新（Rompun，2 %）	Bayer	KP0BFHR
摇床孵育器 Infors Minitron	Infors	-	BSL2 认证
分光光度计	Jenway	20308	600 nm 处测定光密度
分光光度计比色皿	Greiner Bio-One	613101
不锈钢珠（5 mm）	ABF	KU.5G80 1.3541
1 ml 皮下注射器	BD Bioscience	305501
Tissue Lyzer II 组织研磨仪	Qiagen	85300
透气性低致敏胶带（Transpore）	3M	1527-1
吐温 40	Sigma-Aldrich	P1504-100ML
维生素 A 棕榈酸视黄酯眼霜	BAUSCH & LOMB		市售可得