一种用于研究针对细菌病原体免疫反应的小鼠皮肤伤口感染模型

摘要

来源：Anderson, L. S.，等。一种用于评估对Staphylococcus aureus感染先天免疫反应的小鼠模型。J. Vis. Exp. (2019)。

本视频演示了一种建立小鼠皮肤伤口感染模型的技术。通过将基因改造的生物发光金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）——一种致病性细菌——接种至经基因工程改造、可在中性粒细胞中表达荧光蛋白的小鼠体内，可利用整体动物成像技术研究感染部位的细菌负荷量以及中性粒细胞募集的动态过程。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会的审核。

1. 小鼠来源与饲养

1. 如前所述，在 C57BL/6J 遗传背景下培育 LysM-eGFP（在溶菌酶 M（LysM）启动子区域插入增强型绿色荧光蛋白（eGFP））小鼠。通过将 C57BL/6J 背景下的 LysM-EGFP 小鼠与 MyD88^-/-（髓样分化初级反应 88 蛋白）小鼠杂交，获得 LysM-EGFP×MyD88^-/- 小鼠。
2. 将小鼠饲养在动物实验设施中。在本研究中，动物术前在加州大学戴维斯分校群养，术后单笼饲养。使用 10–16 周龄的小鼠进行实验。

2. 细菌制备与定量

1. 移除生物发光信号 金黄色葡萄球菌 aureus 从-80 °C保存条件下取出目标菌株，在冰上解冻。在5%牛血琼脂平板上划线接种。将划线后的平板置于湿润的培养箱中，37 °C过夜（16 h）培养。
   注意： 在本实验方案中，使用了 ALC2906 SH1000 菌株。该菌株含有穿梭质粒 pSK236，其上带有与青霉素结合蛋白 2 启动子融合的 luxABCDE 报告基因盒从 Photorhabdus luminescens.
2. 将胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）粉末按每毫升纯水加入0.03 g的比例溶解，混匀后经高压灭菌以灭菌。冷却后，采用无菌操作技术加入所需的抗生素。在本实验方案中，向TSB中加入终浓度为10 µg/mL的氯霉素，以筛选含有生物发光luxABCDE基因盒的pSK236穿梭质粒的表达。
3. 从平板上挑取3-4个独立的菌落 S. aureus 将菌株接种于含 10 µg/mL 氯霉素的 TSB 培养基中，开始过夜培养。将细菌置于 37 °C 摇床培养箱中孵育过夜（16 h）。
4. 从过夜培养物中取样，按1:50比例稀释至含10 µg/mL氯霉素的TSB培养基中，启动新的细菌培养。在37 °C、200 rpm条件下于摇床培养箱中培养。
5. 分盘后两小时 S. aureus，监测 600 nm 处的光密度（OD₆₀₀) 在分光光度计上测定吸光度（OD）₆₀₀ 与时间的关系以确定对数中期生长阶段。对于 ALC2906 SH1000 菌株，OD₆₀₀ 0.5 处于对数中期，对应浓度为 1 x 10⁸ CFU/mL（CFU = 菌落形成单位）图1).
6. 当OD₆₀₀ 为0.5时，用预冷的Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS）以1:1比例洗涤细菌。将细菌在3,000 x g下离心10分钟 g 以及 4 °C。小心倾去上清液，加入额外的预冷 DPBS 并充分涡旋。再次以 3,000 x g 离心 10 分钟 g 和 4 °C。
7. 小心倾倒上清液。将细菌沉淀重悬于所需浓度的溶液中。本研究中，收集 3 mL 的 ALC2906 SH1000，重悬于 1.5 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）中，对应细菌浓度约为 2 x 10⁸ CFU/mL。使用前将细菌置于冰上保存。
8. 为验证细菌浓度，将100 µL细菌样品用PBS分别稀释1:10,000和1:100,000。取20 µL稀释液接种于琼脂平板上。在37 °C湿润培养箱中培养16 h。通过肉眼观察计数菌落形成单位（CFU），并于次日计算细菌浓度。

3. 切除性皮肤伤口制备及接种 S. aureus

1. 向每只小鼠注射 100 µL 浓度为 0.03 mg/mL 的盐酸布托啡诺溶液（约 0.2 mg/kg） 通过 腹腔注射
2. 注射后20分钟，将2-4只小鼠放入麻醉舱中，以2-3 LPM氧气混合2-4%异氟烷进行麻醉。待小鼠完全麻醉后，逐只转移至连接有2-3 LPM氧气混合2-4%异氟烷的鼻罩装置中。用拇指和食指用力夹捏每只小鼠的后肢足垫以确认其麻醉深度，若小鼠对夹捏无反应，则进行下一步操作。
3. 用电动剪毛器剃除小鼠背部约1英寸×2英寸区域的毛发，并用干净的擦拭纸或纱布清除毛发碎屑。避免使用脱毛乳液，因其可能引起过度炎症反应。
4. 先用含10%聚维酮碘的纱布清洁小鼠背部，再用含70%乙醇的纱布擦拭。以螺旋方式清洁，从手术区域中心向外周移动。手术前等待约1分钟，使手术区域完全干燥。
5. 用两根手指轻轻夹住小鼠背部剃毛区域，将无菌的6 mm打孔活检器在手术准备区域的中心位置用力按压。切勿拉紧皮肤。
   1. 旋转皮肤活检钻，使皮肤上形成一个环形切口，并至少在切口的某一处完全穿透皮肤。注意不要切到深部的筋膜或组织。
   2. 使用无菌剪刀和镊子，沿穿刺活检留下的圆形印迹切割表皮和真皮。

4. S. aureus 接种

1. 用28 G胰岛素注射器吸取所需浓度的生物发光细菌接种物。本研究中，接种浓度为1 × 10⁸ CFU/mL（50 µL）。注射体积不得超过100 µL。
2. 将50 µL接种物注射至小鼠背部伤口中心处的筋膜与组织之间。确保接种物在伤口中心形成气泡，且泄漏或扩散最少。
   1. 将真皮向一侧牵拉，持注射器几乎与组织平行，缓慢刺入组织，直至阻力突然降低，表明已穿透筋膜。小心将注射器引导至伤口中心，缓慢注入接种物。随后缓慢将注射器从小鼠体内抽出。
3. 对未感染动物的伤口，按上述方法注射相同体积的无菌PBS。
4. 将动物放回笼中，将笼子置于加热灯下或加热垫上，并在动物恢复麻醉前持续监测其状态。

5. 体内生物发光成像（BLI）和荧光成像（FLI）

1. 通过仪器软件启动全动物成像仪。将小鼠置于麻醉舱中，以每分钟2-3升氧气流速并含2-4%异氟烷进行麻醉。通过成像仪内的鼻罩输送麻醉气体。
2. 将受伤并感染的小鼠放入成像仪中，调整小鼠位置，使伤口尽可能平展。按照以下序列设置对小鼠进行成像。
   1. 选择生物发光和拍照作为成像模式。曝光时间为1分钟，采用小像素合并模式，光圈F/stop 1（生物发光）和F/stop 8（拍照）。发射滤光片设置为开放。点击采集按钮以记录图像。
   2. 选择荧光和拍照作为成像模式。曝光时间为1秒，采用小像素合并模式，光圈F/stop 1（荧光）和F/stop 8（拍照），激发波长为465/30 nm，发射波长为520/20 nm，并使用高亮度光源。点击采集按钮以记录图像。
3. 将动物放回笼中，并在其恢复麻醉期间持续监测。
4. 按照上述方法每日对小鼠进行成像。

结果

图 1：ALC2906 的 OD₆₀₀ 与 CFU 计数的相关性。从琼脂平板上挑取 3–4 个 ALC2906 SH1000 菌落，转移至含 10 µg/mL 氯霉素的 TSB 培养基中过夜培养。次日，将菌液按 1:50 比例转接到含 10 µg/mL 氯霉素的 TSB 培养基中继续培养。使用分光光度计在培养 2 小时后定期测定 600 nm 处的光密度（OD₆₀₀）。每次测定时，将细菌用冰浴 PBS 稀释 1:100,000，分装至琼脂平板，过夜培养。次日计数菌落形成单位（CFU），以计算初始浓度，并与 OD₆₀₀ 进行相关性分析。每项实验包含...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
14 mL 聚丙烯圆底管	Falcon	352059
6mm 一次性活检穿孔器	Integra Miltex	33-36
生物发光 S. aureus	Lloyd Miller，约翰斯·霍普金斯大学	ALC 2906 SH1000
5% 牛血琼脂，Hardy Diagnostics	VWR	10118-938
盐酸丁丙诺啡注射液	西方医疗用品公司	7292	0.3 mg/mL
C57BL/6J 小鼠	杰克逊实验室	664
氯霉素（结晶粉末）	Fisher BioReagents	BP904-100
DPBS (1X)	Gibco	14190-144
胰岛素注射器	Becton, Dickson and Company	329461	0.35 mm（28 G）× 12.7 mm（1/2″）
IVIS Spectrum 活体成像系统	Perkin Elmer	124262
Living Image 软件 – IVIS Spectrum 系列	Perkin Elmer	128113
LysM-eGFP 小鼠	Thomas Graff 阿尔伯特·爱因斯坦纽约医学院	NA
微量分光光度计	赛默飞世尔科技	ND-2000
MyD88基因敲除小鼠	杰克逊实验室	9088
无纺布海绵	AMD- Ritmed 公司	A2101-CH	5 cm × 5 cm
聚维酮碘 10% 溶液	应用	697731
胰蛋白胨大豆肉汤	Becton, Dickson and Company	211825