一种研究玻璃粘连蛋白在细菌对宿主上皮细胞黏附中作用的检测方法

摘要

来源：Singh, B. 等，研究玻璃粘连蛋白在细菌黏附和血清抗性中作用的实验方法。 J. Vis. Exp. (2018)

在本视频中，我们演示了一种用于研究玻璃粘连蛋白在其中作用的实验方法 流感嗜血杆菌 与宿主上皮细胞的黏附

方案

1. 细菌依赖Vn对上皮细胞黏附性的研究

1. 在75 cm²培养瓶中培养A549细胞（II型肺泡上皮细胞）² 添加了10%（体积/体积）胎牛血清（FCS）（完全培养基）和5 µg/mL庆大霉素的F12培养基组织培养瓶。将培养瓶置于含5% CO₂的培养箱中培养₂ 在37 °C下培养3天，直至细胞融合度达到80%（可通过倒置显微镜观察细胞覆盖表面的程度来估算融合度）。以下四个步骤描述了如何为检测准备上皮细胞。
   1. 用 20 mL 磷酸盐缓冲液轻柔地旋转冲洗细胞培养瓶中的细胞单层两次。为使细胞从培养瓶表面脱离，加入 2 mL 细胞解离酶溶液，于 37 °C 孵育 5 分钟。用手掌轻拍培养瓶，使所有细胞从塑料表面脱落。反复吹打数次以分散细胞团块。
   2. 向烧瓶中加入18 mL F12完全培养基，将全部细胞悬液转移至50 mL无菌Falcon管中。以200 × g离心细胞悬液5分钟。 g 在室温下弃去上清液。将细胞沉淀重悬于10 mL F12完全培养基中。
   3. 取10 µL细胞悬液置于Eppendorf管中，加入90 µL台盼蓝溶液。盖上盖玻片后，将样品加载至血细胞计数板（深度0.1 mm）中。
   4. 计数区域 A、B、C 和 D 中的所有活细胞（每个区域包含 16 个方格，每个方格的面积为 0.0025 mm²）²），然后计算细胞平均数（[A+B+C+D]/4）。使用以下公式计算每毫升的细胞数量：
      可存活细胞数/mL = 平均细胞计数 × 10⁴ × 稀释因子
      注意： 此处，稀释倍数为10。
   5. 将细胞悬液稀释至5.0 x 10³ 细胞/mL，使用含有5 µg/mL庆大霉素的完全培养基。将500 μL细胞悬液分装至24孔细胞培养板的每孔中。将培养板置于37 °C、5% CO₂条件下孵育₂ 直到细胞融合度达到90%。
2. 在细菌感染前，吸出孔板中的培养基，加入不含胎牛血清的F12培养基，于37 °C孵育过夜。
3. 用500 µL PBS在室温下洗涤细胞单层三次。将培养板置于冰上，加入100 µL预冷的含10 µg/mL Vn的F12培养基。在4 °C孵育1小时。对照孔中仅加入F12培养基。
4. 孵育后，用移液器弃去溶液，并在室温下用 1 mL PBS 洗涤细胞层两次。
5. 培养 Hif 在补充有10 µg/mL NAD和血红素的脑心浸液（BHI）培养基中，于37 °C、200 rpm振荡条件下培养临床分离株。使用LB培养基进行培养 E. coli 收获 Hif 对数中期（OD600 = 0.3）收集细菌，用含1%（w/v）牛血清白蛋白（BSA）的磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2）（封闭缓冲液；PBS-BSA）重悬细菌。调整菌液至10⁹ CFU/mL。重悬新鲜培养的菌液 Hif F12 培养基中的 M10（2×10）⁸ CFU/mL）。向每个孔中加入 100 µL 该细菌悬液，于 37 °C 培养 2 小时。
   注意： 每个孔含有约 2 x 10⁵ A549 细胞。用于感染时，取 2 x 10⁷ 添加细菌CFU，对应的感染复数为100。
6. 用移液器吸除培养基，用 PBS 洗涤 A549 上皮细胞 3 次。每孔加入 50 µL 细胞解离液，于 37 °C 培养箱中孵育 5 分钟。
7. 接着，每孔加入 50 µL F12 完全培养基以终止酶促反应。转移上皮细胞（≈100 μL [即，每个孔的全部体积）转移至含有四颗玻璃珠的6 mL玻璃试管中。在室温下涡旋振荡2分钟以裂解细胞。
8. 将10 µL细胞裂解液加入990 µL F12培养基中，进行100倍稀释。取10 µL稀释后的样品接种于巧克力琼脂平板上。
9. 将巧克力琼脂平板在37 °C下孵育过夜，然后计数菌落。每个菌落代表一个CFU。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5 mL 聚苯乙烯圆底试管	BD Falcon	60819-138	12 × 75 mm 型
5% CO2 培养箱	Thermo Scientific	BBD6220
6 mL 聚苯乙烯圆底试管	VWR	89000-478	12 × 75 mm 型，带盖
24 孔板	BD Falcon	08-772-1H	细胞培养级
75 cm2 组织培养瓶	BD Falcon	BD353136	透气型
A549 细胞系（人源）	Sigma-Aldrich	86012804-1VL
细胞解离酶（Accutase）	Sigma-Aldrich	A6964-500ML	细胞培养级
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma-Aldrich	A2058	适用于细胞培养
F12 培养基	Sigma-Aldrich	D6421	细胞培养级
胎牛血清（FCS）	Sigma-Aldrich	12003C	适用于细胞培养
血细胞计数板	Marienfeld	640210
组织培养瓶	BD Falcon	3175167	75 cm2
人血浆来源的玻璃粘连蛋白（Vn）	Sigma-Aldrich	V8379-50UG	细胞培养级