一种研究玻璃粘连蛋白在细菌对宿主上皮细胞黏附中作用的检测方法

摘要

来源：Singh, B. 等，研究玻璃粘连蛋白在细菌黏附和血清抗性中作用的实验方法。 J. Vis. Exp. (2018)

在本视频中，我们演示了一种用于研究玻璃粘连蛋白在其中作用的实验方法 流感嗜血杆菌 与宿主上皮细胞的黏附

方案

1. 细菌依赖Vn对上皮细胞黏附性的研究

1. 在75 cm²培养瓶中培养A549细胞（II型肺泡上皮细胞）² 添加了10%（体积/体积）胎牛血清（FCS）（完全培养基）和5 µg/mL庆大霉素的F12培养基组织培养瓶。将培养瓶置于含5% CO₂的培养箱中培养₂ 在37 °C下培养3天，直至细胞融合度达到80%（可通过倒置显微镜观察细胞覆盖表面的程度来估算融合度）。以下四个步骤描述了如何为检测准备上皮细胞。
   1. 用 20 mL 磷酸盐缓冲液轻柔地旋转冲洗细胞培养瓶中的细胞单层两次。为使细胞从培养瓶表面脱离，加入 2 mL 细胞解离酶溶液，于 37 °C 孵育 5 分钟。用手掌轻拍培养瓶，使所有细胞从塑料表面脱落。反复吹打数次以分散细胞团块。
   2. 向烧瓶中加入18 mL F12完全培养基，将全部细胞悬液转移至50 mL无菌Falcon管中。以200 × g离心细胞悬液5分钟。 g 在室温下弃去上清液。将细胞沉淀重悬于10 mL F12完全培养基中。
   3. 取10 µL细胞悬液置于Eppendorf管中，加入90 µL台盼蓝溶液。盖上盖玻片后，将样品加载至血细胞计数板（深度0.1 mm）中。
   4. 计数区域 A、B、C 和 D 中的所有活细胞（每个区域包含 16 个方格，每个方格的面积为 0.0025 mm²）^2<....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5 mL 聚苯乙烯圆底试管	BD Falcon	60819-138	12 × 75 mm 型
5% CO2 培养箱	Thermo Scientific	BBD6220
6 mL 聚苯乙烯圆底试管	VWR	89000-478	12 × 75 mm 型，带盖
24 孔板	BD Falcon	08-772-1H	细胞培养级
75 cm2 组织培养瓶	BD Falcon	BD353136	透气型
A549 细胞系（人源）	Sigma-Aldrich	86012804-1VL
细胞解离酶（Accutase）	Sigma-Aldrich	A6964-500ML	细胞培养级
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma-Aldrich	A2058	适用于细胞培养
F12 培养基	Sigma-Aldrich	D6421	细胞培养级
胎牛血清（FCS）	Sigma-Aldrich	12003C	适用于细胞培养
血细胞计数板	Marienfeld	640210
组织培养瓶	BD Falcon	3175167	75 cm2
人血浆来源的玻璃粘连蛋白（Vn）	Sigma-Aldrich	V8379-50UG	细胞培养级